劉云飛，季 德，張春鳳，楊中林

(中國(guó)藥科大學(xué)現(xiàn)代中藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009)

HPLC－TOF/MS歸屬續(xù)斷指紋圖譜中的化學(xué)成分

劉云飛，季 德，張春鳳，楊中林*

(中國(guó)藥科大學(xué)現(xiàn)代中藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009)

目的：對(duì)續(xù)斷指紋圖譜進(jìn)行成分歸屬研究，為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制其質(zhì)量提供依據(jù)。方法：采用HPLCTOF/MS技術(shù)，通過正離子模式和負(fù)離子模式檢測(cè)獲得精確分子量，結(jié)合文獻(xiàn)和對(duì)照品推測(cè)續(xù)斷HPLC－TOF/MS指紋圖譜中的化學(xué)組成。結(jié)果：采用HPLC－TOF/MS法推測(cè)了15個(gè)成分，用對(duì)照品確認(rèn)了木通皂苷D、綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、川續(xù)斷皂苷V、川續(xù)斷皂苷X、川續(xù)斷皂苷VII和3－O－L－吡喃阿拉伯糖－常春藤皂苷元等8個(gè)成分。結(jié)論：該研究比較全面地闡明了續(xù)斷的化學(xué)組成，使指紋圖譜的特征性更強(qiáng)，為續(xù)斷的鑒別與質(zhì)量評(píng)定奠定了基礎(chǔ)。

續(xù)斷;HPLC－TOF/MS;指紋圖譜;質(zhì)量控制

續(xù)斷為川續(xù)斷科川續(xù)斷屬植物川續(xù)斷Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，具有豐富的藥理活性［1］。

續(xù)斷藥材有效成分含量與氣候、土壤等生態(tài)環(huán)境有關(guān)，不同來源的續(xù)斷形態(tài)和化學(xué)組成相似，難以用形態(tài)學(xué)和簡(jiǎn)單的理化鑒定來區(qū)分。以往研究續(xù)斷的指紋圖譜，對(duì)續(xù)斷中的化學(xué)成分的鑒定研究較少［2－4］。本文在前期研究續(xù)斷HPLC指紋圖譜的基礎(chǔ)上［2］，采用了HPLC－TOF/MS和對(duì)照品確認(rèn)兩種方法，對(duì)續(xù)斷指紋圖譜中的化學(xué)成分進(jìn)行研究，歸屬了23個(gè)成分，為評(píng)價(jià)續(xù)斷質(zhì)量進(jìn)一步提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1100 HPLC(四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器，Agilent);高分辨質(zhì)譜(Agilent);乙腈(色譜純，Merck);水(樂百氏食品飲料有限公司);甲醇(分析純，江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司);乙醇(分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司);甲酸(分析純，ROE Scientific INC);木通皂苷 D(浙江省藥檢所，20041209);綠原酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所，110753－200413);咖啡酸(上海試劑一廠，88－11－01);馬錢苷、川續(xù)斷皂苷V、川續(xù)斷皂苷X、川續(xù)斷皂苷VII和3－O－L－吡喃阿拉伯糖－常春藤皂苷元(自制，采用歸一化法測(cè)得純度均大于98%，光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［5－10］);續(xù)斷藥材(四川涼山產(chǎn)，經(jīng)自我鑒定分別為川續(xù)斷Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取續(xù)斷藥材粗粉2.5 g，置于50 mL燒瓶中，加入60%乙醇25 mL，浸泡1h，分別以25 mL、20 mL、20 mL的60%乙醇，各加熱回流提取1次，時(shí)間分別為 90 min，60 min，30 min，合并 3 次續(xù)濾液，減壓回收乙醇至無醇味，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用純水定容至刻度，搖勻，12 000 r/min，離心10 min，取上清液，即得 50 mg·mL－1的供試品溶液，用 200 μL 移液槍精密移取200 μL置1.5 mL的離心管內(nèi)，再移取 200 μL 的純凈水，渦旋 30 s，即得 25 mg·mL－1的供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品(綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、川續(xù)斷皂苷V、木通皂苷D、川續(xù)斷皂苷X、川續(xù)斷皂苷VII和3－O－L－吡喃阿拉伯糖－常春藤皂苷元)1 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成濃度0.1 mg·mL－1的對(duì)照品溶液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，備用。

2.3 HPLC色譜條件和HPLC－TOF/MS質(zhì)譜條件研究

HPLC色譜條件參考文獻(xiàn)［2］。在HPLC－TOF/MS質(zhì)譜條件中，流動(dòng)相水相更換為0.1%甲酸水溶液，進(jìn)樣量為 5 μL，其他色譜條件與文獻(xiàn)［2］相同。離子掃描范圍m/z 100～1800。電噴霧離子源條件如下：氮?dú)饬魉伲?.0 L·min－1;溫度：320 ℃;噴霧器：35 psig;毛細(xì)管電壓：3000 V。

采用正離子和負(fù)離子兩種分析模式，檢測(cè)到續(xù)斷主要的分子離子峰有［M－H］－，［M+HCOO］－和［M+H］+3種形式。為了更直觀的觀察和識(shí)別峰的形態(tài)，選取了25 mg·mL－1和50 mg·mL－12 個(gè)濃度。在50 mg·mL－1濃度下，由于前5 min出峰的物質(zhì)和木通皂苷D(標(biāo)號(hào)為17)響應(yīng)值較高會(huì)造成質(zhì)譜響應(yīng)過載，影響后續(xù)分析，此部分未進(jìn)質(zhì)譜儀，故在圖1(B)中此段沒有響應(yīng)。

圖 1 續(xù)斷藥材的總離子圖譜(A：25 mg·mL－1，負(fù)離子模式;B：50 mg·mL－1，負(fù)離子模式;C：50 mg·mL－1，正離子模式)

2.4 HPLC－TOF/MS指紋圖譜分析

按照文獻(xiàn)［2］的色譜條件，建立續(xù)斷HPLC指紋圖譜和8個(gè)對(duì)照品的色譜圖。以保留時(shí)間相近為原則，確認(rèn)了綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、木通皂苷D、川續(xù)斷皂苷X、川續(xù)斷皂苷VII、川續(xù)斷皂苷V和3－O－L－吡喃阿拉伯糖－常春藤皂苷元等8個(gè)成分，8個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2，歸屬結(jié)果如表1所示。

圖2 8個(gè)對(duì)照品的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

采用HPLC－TOF/MS獲取23個(gè)化合物(標(biāo)記如圖1)的精確分子量，分析同一化合物在正、負(fù)離子兩種模式下的離子形式(［M －H］－，［M+HCOO］－和［M+H］+)，確定每個(gè)化合物的分子量，結(jié)合從續(xù)斷中分離得到的化合物，推測(cè)了15個(gè)成分，推測(cè)結(jié)果如表1所示。

3 討論

由于續(xù)斷中各化學(xué)成分的含量差異較大，為了使含量低的化合物也能在譜圖中顯示，本實(shí)驗(yàn)選取了25 mg·mL－1和50 mg·mL－1兩個(gè)濃度。從圖 1 中可以看出，在負(fù)離子模式下，當(dāng)供試品溶液濃度為50 mg·mL－1時(shí)，前90 min譜圖峰形較好且分離度較高(圖1(B));當(dāng)供試品溶液濃度為25 mg·mL－1時(shí)，90 min后各峰響應(yīng)值適宜如圖1(A)。續(xù)斷中化學(xué)成分主要由皂苷、環(huán)烯醚萜和黃酮類等化合物組成［1］，這些化合物在負(fù)離子模式下，更容易檢測(cè)到［M－H］－和［M+HCOO］－離子，所以圖1中(A，B)中各個(gè)峰響應(yīng)值較高。采用負(fù)離子模式得到的續(xù)斷HPLC－TOF/MS指紋圖譜各峰分離的較好，故續(xù)斷HPLC－TOF/MS指紋圖譜采用負(fù)離子模式檢測(cè)較為適宜，是目前研究續(xù)斷指紋圖譜較為完善的分析方法。

前期對(duì)續(xù)斷HPLC指紋圖譜研究缺乏成分的歸屬［2］，故本論文采用HPLC－TOF/MS技術(shù)結(jié)合對(duì)照品對(duì)續(xù)斷HPLC指紋圖譜中的色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)合HPLC－TOF/MS圖譜信息和續(xù)斷的文獻(xiàn)報(bào)道，在HPLC－TOF/MS圖譜中初步指認(rèn)了23個(gè)化合物。但上述23個(gè)化合物的指認(rèn)是推測(cè)結(jié)果，我們進(jìn)一步采用對(duì)照品進(jìn)行了確認(rèn)，因?yàn)閷?duì)照品有限，目前我們只確認(rèn)出其中的8個(gè)化合物，較文獻(xiàn)報(bào)道的指紋圖譜增加了5個(gè)化合物的確認(rèn)［14］，使續(xù)斷指紋圖譜特征性更強(qiáng)，給續(xù)斷的質(zhì)量控制研究提供了更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

表1 續(xù)斷中化學(xué)成分的推測(cè)結(jié)果

［1］ Zhao Y M，Shi Y P.Phytochemicals and Biological Activities of Dipsacus Species［J］.Chem Biodivers，2010，8：414 －430.

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［3］ 曹越，彭維，蘇薇薇，等.續(xù)斷藥材指紋圖譜的研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21(1)：51－54.

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［7］ 張永文，薛智.川續(xù)斷中皂苷IX和X的結(jié)構(gòu)研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992，27(12)：912－917.

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［9］ 張永文，薛智.川續(xù)斷的化學(xué)成分研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1991，26(9)：676－681.

［10］ Zemtsova G N，Bandyukova V A，Shinkarenko A L.C－Glycosides of Dipsacaceae species［J］.Him Prir Soedin，1972(5)：678.

［11］ Hung T M，Na M K，Thuong P T，et al.Antioxidant activity of caffeoyl quinic acid derivatives from the roots of Dipsacus asper Wall［J］.J Ethnopharmacol，2006，108(2)：188 －192.

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Identification of the Constituents of Dipsacus asperoides by HPLC－TOF/MS

Liu Yunfei，Ji De，Zhang Chunfeng，Yang Zhonglin*
(Key Laboratory of Modern Chinese Medicines，Ministry of Education，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009 China)

Objective：Research was performed on HPLC－TOF/MS fingerprint to identify compounds in Dipsacus asperoides.Method：The accurate mass was obtained by HPLC －TOF/MS in both positive and negative ion modes.Combined with literatures components were concluded in D.asperoides by chemical substances.Results：Fifteen components were concluded and eight(chlorogenic acid，asperosaponin VI，loganin，akebia saponin X，akebia saponin VII，akebia saponin V and 3－O－α－L－arabinopyranosyl－h(huán)ederagenin)were identified by comparing with standard substances.Conclusion：This study gave more details of chemical constituents of D.asperoides，which made fingerprint more characteristic.HPLC－TOF/MS technique could be used in quality control of D.asperoides.

Dipsacus asperoides;HPLC－TOF/MS;fingerprint;quality control

R917

A

1006－9690(2012)03－0022－04

10.3969/j.issn.1006－9690.2012.03.007

2011－12－11

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)課題(中藥鹽制與咸入腎、腎主骨相關(guān)性研究，30730113)和江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

劉云飛(1985－)，男，碩士，主要從事中藥質(zhì)量控制研究。

*通訊作者：楊中林。E －mail：yzl1950@yahoo.com.cn