平 萍，張廷水，張朝鳳，許翔鴻，張 勉

(中國(guó)藥科大學(xué)教育部現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生藥學(xué)研究室，江蘇南京211198)

蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)作用

平 萍，張廷水，張朝鳳*，許翔鴻，張 勉

(中國(guó)藥科大學(xué)教育部現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生藥學(xué)研究室，江蘇南京211198)

目的：研究中藥活性物質(zhì)蟛蜞菊內(nèi)酯的保肝作用及其機(jī)制。方法：采用小鼠腹腔注射CCl4制作肝損傷模型，測(cè)定小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)，谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)指標(biāo)，進(jìn)行肝臟的組織病理學(xué)檢查，觀察蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)CCl4所致肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果：蟛蜞菊內(nèi)酯能明顯降低肝損傷小鼠的血清ALT、AST和肝組織勻漿中MDA含量，SOD活力增強(qiáng)，明顯減輕肝組織變性。結(jié)論蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)CCl4引起的肝損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)。

蟛蜞菊內(nèi)酯;肝損傷;四氯化碳

蟛蜞菊內(nèi)酯是從蟛蜞菊［Wedelia calandulaceae(Osbeck.)Merr.］、墨旱蓮(Eclipta prostrate L.)等植物中分得的香豆草醚類化合物［1-2］。蟛蜞菊屬植物在亞洲和南美等地區(qū)常用來(lái)治療膿毒性休克，肝臟疾病，病毒感染和毒蛇咬傷［2-4］。蟛蜞菊內(nèi)酯可能是蟛蜞菊和墨旱蓮中發(fā)揮保肝活性的主要化合物之一?，F(xiàn)代研究表明墨旱蓮50%的乙醇提取物通過(guò)調(diào)整肝微粒體代謝酶在亞細(xì)胞水平對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷有顯著的保護(hù)作用［5］，體外實(shí)驗(yàn)顯示蟛蜞菊內(nèi)酯具有抗四氯化碳、氨基半乳糖(Galc)和毒傘素(phalloidin)誘導(dǎo)的急性肝損傷，并可刺激肝細(xì)胞再生［3］。然而以上均在細(xì)胞水平上研究蟛蜞菊內(nèi)酯的保肝活性，考慮到體內(nèi)作用影響因素較多，可能與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所偏差，同時(shí)也為了進(jìn)一步驗(yàn)證蟛蜞菊單體物質(zhì)的保肝活性，所以本實(shí)驗(yàn)采用CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型，結(jié)合生化指標(biāo)和形態(tài)學(xué)觀察，確證蟛蜞菊內(nèi)酯的保肝作用，并探討蟛蜞菊內(nèi)酯保肝作用的可能作用機(jī)制。

圖1 蟛蜞菊內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

ICR雄性小鼠，60只，體重(20.0±2.0)g，購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。合格證號(hào)：SCXK(蘇)2007-0001。

蟛蜞菊內(nèi)酯自提，純度98%，CCl4為國(guó)產(chǎn)分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20091123，用植物油配成0.15%CCl4;聯(lián)苯雙酯，購(gòu)自浙江萬(wàn)邦藥業(yè)有限公司，用吐溫-80配成100g/L;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，谷胱甘肽(GSH)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)為20101223，20101224，20101228，20101227，20101223。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及數(shù)據(jù)處理

小鼠60只(20.0±2.0)g，隨機(jī)分為6組，每組10只。分模型組、空白組，蟛蜞菊內(nèi)酯低劑量(11 mg/kg)，中劑量(22 mg/kg)，高劑量組(44 mg/kg)及陽(yáng)性藥組(為0.1 g/kg的聯(lián)苯雙酯)，給藥體積為20 mL/kg?？瞻捉M按20 mL/kg灌胃給予0.5%的吐溫-80溶液。給藥組和陽(yáng)性藥組先分別連續(xù)灌胃給藥7天，每天1次，第6天上午給藥后1 h，模型組與陽(yáng)性藥組一次性腹腔注射0.15%的CCl4溶液造成肝損傷。造模后20 h，眼框取血，3 500 r/min離心5 min，分離血清，用生化分析儀測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性。并取肝臟右葉同一部位經(jīng)10%甲醛固定，HE染色作病理檢查，另取小塊肝臟組織，用冷生理鹽水洗去浮學(xué)，拭干，稱取0.5g肝組織，加5mL冷生理鹽水制成10%的肝勻漿，放入-20℃冰箱中備測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，谷胱甘肽(GSH)指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表所示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠血清中ALT、AST的影響

由表1可以看出，模型組與正常組相比，血清ALT，AST水平極顯著升高(P＜0.01)，說(shuō)明建模成功。與模型組相比，蟛蜞菊內(nèi)酯各劑量組血清ALT，AST水平均明顯降低，且呈劑量依賴性，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著(P＜0.01)，中劑量與陽(yáng)性藥聯(lián)苯雙酯的藥效相當(dāng)，表明蟛蜞菊內(nèi)酯可以減輕CCl4所致小鼠急性肝損傷。

表1 蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)CCl4肝損傷小鼠血清ALT、AST活力的影響(±s，n=10)

表1 蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)CCl4肝損傷小鼠血清ALT、AST活力的影響(±s，n=10)

注：與空白組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 劑量(mg/kg) ALT(U/L) AST(U/L)- 12.59±5.47 12.29±3.14模型 - 91.03± 26.89＊＊ 85.62± 40.48＊＊蟛蜞菊內(nèi)酯 11 42.72± 21.83△△ 24.181± 3.89△△22 33.50 ± 29.34△△ 19.35 ± 12.40△△44 26.25 ± 11.35△△ 12.87 ± 4.92△△聯(lián)苯雙酯 100 30.49±14.17△△ 18.87± 11.39空白△△

2.2 對(duì)小鼠肝臟SOD，MDA，GSH的影響

各組小鼠SOD，MDA，GSH活力見(jiàn)表2。由表2可以看出，模型組與正常組相比，MDA明顯增高，SOD顯著降低，GSH顯著升高(P＜0.01)，說(shuō)明建模成功。蟛蜞菊內(nèi)酯各劑量與模型組相比，肝組織MDA明顯降低(P＜0.01)，SOD明顯增高(P＜0.05，P＜0.01);GSH 明顯降低(P＜0.01)，且呈劑量依賴關(guān)系，高劑量組中各個(gè)指標(biāo)均高于陽(yáng)性藥物組，結(jié)果表明蟛蜞菊內(nèi)酯可能具有一定的抗氧化作用。

表2 蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)CCl4肝損傷小鼠肝臟MDA含量、SOD和GSH活性的影響(±s，n=10)

表2 蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)CCl4肝損傷小鼠肝臟MDA含量、SOD和GSH活性的影響(±s，n=10)

與空白組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01與模型組比較△P＜0.05，△△P ＜0.01

組別 劑量(mg/kg)MDA(mol/mg)SOD(ng/mg pro)GSH(μg/mg pro)- 0.78±0.28 74.68±22.45 2.16±1.24模型 - 1.21 ±0.30＊＊ 21.56±3.54＊＊ 8.24 ±3.91＊＊蟛蜞菊內(nèi)酯 11 0.83 ±0.24△△ 25.16±3.76△ 3.28 ±2.27△△22 0.77 ±0.31△△ 37.56±16.81△△ 2.46±1.89△△44 0.79 ±0.25△△ 49.52 ±23.20△△ 2.24 ±2.75△△聯(lián)苯雙酯 100 0.92±0.29* 29.66±11.68 3.50±3.16空白△△

2.3 蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)肝損傷小鼠肝臟病理改變的影響

按照上述實(shí)驗(yàn)方法，取給藥7 d后各組的小鼠肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。結(jié)果表明，正常組，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝索放射狀排列，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核居中;匯管區(qū)未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。肝損傷模型組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝索呈放射狀排列，肝細(xì)胞呈灶性細(xì)胞水腫，可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死及碎片狀壞死。蟛蜞菊內(nèi)酯給藥組肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，敢說(shuō)呈放射狀排列，肝細(xì)胞造型細(xì)胞水腫，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死及碎片狀壞死明顯減輕，與模型組相比各給藥組肝臟病理變化均有所改善(圖2)。

圖2 蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)CCl4致小鼠肝損傷組織病理形態(tài)學(xué)的影響

3 討論

本文選擇經(jīng)典的CCl4化學(xué)性肝損傷的動(dòng)物模型來(lái)研究墨旱蓮中蟛蜞菊內(nèi)酯的肝臟保護(hù)作用，CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷動(dòng)物模型是篩選保肝藥物和抗肝纖維化的較常用的動(dòng)物模型之一。CCl4肝損傷機(jī)制研究較多，存在多種意見(jiàn)，但一直公認(rèn)，主要與脂質(zhì)過(guò)氧化物有關(guān)，脂質(zhì)過(guò)氧化物使細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，通透性增高，線粒體膜受損，細(xì)胞產(chǎn)能障礙，活性氧生成增多，造成細(xì)胞損傷［6］。CCl4能夠在肝內(nèi)主要被CCl4能夠在肝內(nèi)主要被微粒體細(xì)胞色素氧化酶代謝，生成2個(gè)活性自由基(·CCl3和·Cl)及一系列氧活性產(chǎn)物，通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化物的破壞，使細(xì)胞膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，膜磷脂大量降解，從而破壞生物膜結(jié)構(gòu)的完整性，引起膜通透性升高影響細(xì)胞代謝功能和能量的生成［7］。肝細(xì)胞在上述自由基損傷作用下，會(huì)釋放出特異的標(biāo)志性的酶成分。例如ALT存在于肝細(xì)胞漿中，肝內(nèi)酶活性較血清約高100倍，因此只要有1%肝細(xì)胞壞死，即可使血漿中的ALT上升1倍，因此它是檢測(cè)肝細(xì)胞損傷最敏感的指標(biāo)之一。AST在心肌細(xì)胞中含量最高，肝為第二位，在肝損害時(shí)其漏出量較ALT低。本研究中模型組血清的ALT和AST水平顯著升高，陽(yáng)性藥、各劑量給藥組均能顯著降低ALT、AST，顯示保護(hù)肝細(xì)胞的作用。蟛蜞菊內(nèi)酯在11 mg/kg～44 mg/kg范圍內(nèi)成劑量依賴，中劑量與陽(yáng)性藥聯(lián)苯雙酯的藥效相當(dāng)。SOD是體內(nèi)降解、清除自由基的主要抗氧化酶。在自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中，不飽和脂肪酸氧化分解可釋放MDA等醛類物質(zhì)，因此可以通過(guò)檢測(cè)MDA含量來(lái)反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度［8］。本次研究中可以看出給予CCl4后，SOD極顯著降低，MDA和GSH極顯著升高，蟛蜞菊內(nèi)酯低、中、高劑量各組能夠顯著升高SOD水平。同時(shí)可顯著降低MDA和GSH水平。此結(jié)果說(shuō)明蟛蜞菊內(nèi)酯具有一定的抗氧化作用。與模型組比較，各劑量組中病理組織形態(tài)學(xué)有明顯改善，隨劑量增加而藥效明顯。

綜上所述。蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)于四氯化碳所致急性肝損傷具有明顯保護(hù)作用，本研究提示了蟛蜞菊內(nèi)酯的可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究此活性物質(zhì)的體內(nèi)代謝與組織分布提供了依據(jù)。

［1］ Govindanchari T R，Nagurajan K，Pai B R.Chemical examination of Wedelia calendulacea..Part 1.Structure of wedelolactone［J］.Chem Soc，1956：629-632.

［2］ Mors W B，Nascimento M C，Parente J P，et al.Neutralization of lethal and myotoxic activities of South American rattlesnake venom by extracts and constituents of the plant Eclipta prostrate(Asteraceae)［J］.Toxicon，1989，27(9)：1003-1009.

［3］ Wagner H，Geyer B，Kisp Y，et al.Coumestans as the main active principles of the liver drugs Eclipta alba and wedelia calenulaceae［J］.Planta Med，1986，10(5)：370-374.

［4］ Kobori M，Yang Z，Gong D，et al.Wedelolactone suppresses LPS-induced caspase-11 expression by directly inhibiting the IKK complex［J］.Cell Death Differ，2004，11：123-130.

［5］ Saxena A K，Singh B，Anand K K.Hepatoprotective effects ofEclipta alba on subcellular levels in rats［J］.Journal of Ethnopharmacology，1993，40(3)：155-161.

［6］ Shah H，Hartman S P，Weinhouse S.Formation of carbony chloride in carbon tetrachloride metabolism by rat liver in vitro［J］.Cancer Res，1979，39(10)：3942.

［7］ Berger M L，Bhatt H，Combes B，et al.CCl4induced toxicity insolated hepatocytes，the importance of direct solvent injury［J］.Hepatology，1986，6(1) ：36-45.

［8］ 魏屏，彭漢光，黃坤，等.加味四逆散對(duì)D氨基半乳糖所致急性肝損傷大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的影響及病理改變同步觀察［J］.同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，29(3)：268-270.

Effects of Wedelolactone on Mice’s Acute Hepatic Injury Induced by Carbon Tetrachloride

Ping Ping，Zhang Chaofeng*，Xu Xianghong，Zhang Mian
(Key Laboratory of Modern Chinese Medicines，Ministry of Education;Research Department of Pharmacognosy，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China)

Objective：To estimate the effect of Wedelolactone on mice’s acute hepatic injury caused by carbon tetrachloride(CCl4).Methods：The model of acute hepatic injury caused by CCl4was obtained on mice，and the content of AST，ALT in mice serum，MDA and SOD in mice liver cell were evaluated，and the section form of liver pathological organization were also observed.Results：Wedelolactone could markedly inhibit the activities ALT，AST and the levels of MDA，increased the activities of SOD，in addition，histological changes were effectively lessened.Conclusions：Wedelolactone has significant effect on protecting mice’s acute hepatic injury caused by CCl4the mechanism may be related to its anti-oxidative action.

wedelolactone;hapatic injury;carbon tetrachloride

R285.5

A

1006-9690(2012)05-0041-03

10.3969/j.issn.1006-9690.2012.05.0011

2012-02-14

國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(NFFTBS)(J0630858)

平萍(1987-)，女，漢族，山西長(zhǎng)治人，碩士研究生，研究方向：生藥活性成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

*通訊作者：張朝鳳，副研究員。E-mail：njchaofeng@126.com