葛益銀，張凌云

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州510642)

廣西甜茶苷柱純化工藝研究

葛益銀，張凌云

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州510642)

以含70%的廣西甜茶粗提取物為原料，通過柱純化與重結(jié)晶對(duì)甜茶苷進(jìn)行提純，從而制備高純度的甜茶苷單體。以聚酰胺和LSA－10大孔吸附樹脂樹脂為吸附劑乙醇為洗脫劑進(jìn)行柱純化。實(shí)驗(yàn)表明，比較聚酰胺與大孔吸附樹脂的吸附與脫附能力，皆為后者強(qiáng);比較不同吸附材料處理所得甜茶苷單體的純度，則是聚酰胺所吸附的樣純度高，特別是25%乙醇的處理樣。

甜茶苷;柱純化;聚酰胺;大孔吸附樹脂;HPLC

眾所周知，適量蔗糖可以增加機(jī)體ATP的合成，有利于氨基酸的活力與蛋白質(zhì)的合成。但攝入過多的蔗糖則容易導(dǎo)致肥胖癥和齲齒，而且間接導(dǎo)致糖尿病和冠心病等的發(fā)生。因此，開發(fā)無(低)糖、低能量甜味劑是至關(guān)重要的。

羅漢果、甜葉菊和甜茶是廣西最為知名的三大甜味植物，其中甜茶的口感是人們最易接受，也是世界上所發(fā)現(xiàn)的甜味植物中最為理想的［1］。廣西甜茶(Rubus suavussumus S.Lee)，落葉灌木，味甜可食。20世紀(jì)80年代由植物學(xué)家李樹剛命名為懸鉤子屬的一個(gè)變種，主要分布在廣西的柳州、桂林、梧州等地區(qū)［2］。甜茶的主要甜味成分是甜茶苷(Rubusoside)，又稱甜茶素、甜葉懸鉤子苷，為斯替維醇(Steviol)和葡萄糖結(jié)合而成的四環(huán)二萜甙，分子式為C32H50O13，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與甜葉菊苷(Stevioside，斯替維甙)相似［3］。甜茶苷的甜味純正程度接近蔗糖，但其相對(duì)甜度是2%蔗糖溶液的150倍［4］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)甜茶苷的研究主要集中在提取、測(cè)定、藥理及應(yīng)用研究，對(duì)純品的制備研究略有涉及，但工業(yè)化的生產(chǎn)投入則幾乎沒有。過去多采用有機(jī)溶劑萃取和離子交換樹脂等方法對(duì)甜茶苷進(jìn)行提取，但溶劑萃取法有溶劑殘留，離子交換處理的處理量小，二者的提取率比較低［5］。根據(jù)陳全斌等對(duì)高濃度甜茶苷的制備和周如金等對(duì)大孔吸附樹脂提取甜茶苷的研究［3，6］，本次實(shí)驗(yàn)以含70%甜茶苷的甜茶提取物為原料，用聚酰胺粉和大孔樹脂對(duì)甜茶苷進(jìn)行吸附，采用蒸餾水和不同梯度的乙醇進(jìn)行解析，以柱純化、重結(jié)晶等實(shí)驗(yàn)方法研究制備高純度的甜茶苷單體，從而選出一個(gè)相對(duì)最適方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

淡黃色粉末狀甜茶苷樣品(純度70%)、甜茶苷對(duì)照樣(純度98.4%)，桂林集琦實(shí)力天然物有限公司;聚酰胺粉(100－200目)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;LSA－10大孔吸附樹脂，西安藍(lán)曉科技有限公司;95%乙醇(食用級(jí));甲醇(分析純AR，色譜純LC);超純水，蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器

AB204－N電子分析天平，上海人和科學(xué)儀器有限公司;THA－82A臺(tái)式恒溫振蕩器，江蘇金壇新一佳儀器廠;DK－8D電熱恒溫水浴鍋，上海世義精密儀器有限公司;RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;AGILENT 1200液相色譜儀，Agilent—安捷倫科技有限公司;依利特色譜柱(填料：Hypersil ODS2 5 μm，尺 寸：4.6mm × 250 mm，柱 號(hào)：E1912578，批號(hào)：5/120/8619);聚偏氟乙烯微孔濾膜(F型)，上海興亞凈化材料廠;針頭濾膜(有機(jī)系，0.45 μm);一次性使用無菌注射器;其他實(shí)驗(yàn)儀器：40 mm×500 mm層析柱。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 吸附劑預(yù)處理

2.1.1 聚酰胺預(yù)處理

聚酰胺粉，用90% ～95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入柱中，用3～4 BV(BV為層析柱中樹脂床的體積)的90% ～95%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘?jiān)Ｔ僖来斡?～2.5 BV的5%NaOH溶液、1 BV的蒸餾水、2～2.5 BV的10%醋酸水溶液洗脫，分別除去醇溶性、堿溶性和酸溶性雜質(zhì)，最后用蒸餾水洗脫至pH中性，備用。

2.1.2 大孔吸附樹脂預(yù)處理

大孔吸附樹脂，用無水乙醇浸泡24 h，除去氣泡后裝柱，再用無水乙醇洗脫，洗至洗脫液透明無白色渾濁，然后依次用2 BV的質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaOH溶液，3 BV的3%HCl溶液洗脫，分別除去醇溶性、堿溶性和酸溶性雜質(zhì)，最后用蒸餾水洗脫至pH中性，備用。

2.2 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，參考文獻(xiàn)［6］，具體步驟如下：準(zhǔn)確稱取經(jīng)過預(yù)處理的聚酰胺和大孔吸附樹脂各1.0 g，放置于三角瓶中，各加入質(zhì)量濃度為6.0 g/L的甜茶苷樣品溶液100 mL，搖勻室溫放置24 h(每8 h搖動(dòng)1次)后過濾，測(cè)定濾液中甜茶苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附量(Qe)和吸附率(E)。

式中：c0－吸附前溶液質(zhì)量濃度，g/L;ce－吸附后質(zhì)量溶液濃度，g/L;v1－溶液體積，mL;Qe－吸附量，mg/g;m－吸附劑干質(zhì)量;E－吸附率，%。

2.3 靜態(tài)脫附實(shí)驗(yàn)

靜態(tài)脫附實(shí)驗(yàn)，參考文獻(xiàn)［6］，具體步驟如下：按上述2.2靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，制得吸附了甜茶苷并經(jīng)過濾的聚酰胺4組，大孔吸附樹脂4組。分別加入60 mL蒸餾水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇，置于搖床緩慢振動(dòng)進(jìn)行解析(搖床溫度設(shè)置為25℃)，24 h后測(cè)解析液質(zhì)量濃度，計(jì)算解析率。

式中：cd－脫吸液質(zhì)量濃度，g/L;v2－脫吸液體積，mL;Qd－脫附量，mg/g;D－解析率，%。

以上，靜態(tài)吸附與脫附實(shí)驗(yàn)中c0、ce、cd均進(jìn)行HPLC高效液相色譜分析，通過峰面積換算得出。

2.4 甜茶苷的單體制備

甜茶苷的單體制備，依據(jù)靜態(tài)吸附與脫附實(shí)驗(yàn)，參考文獻(xiàn)［3，6］，具體實(shí)驗(yàn)步驟優(yōu)化如下。取甜茶苷樣品3 g，用蒸餾水溶解并定容至10 mL，過層析柱(40 mm×500 mm)，收集柱流液，并用脫附劑(蒸餾水，25%，50%，75%的食用乙醇)淋洗至無甜味，流速為3 BV/h，合并液體，旋干回收(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃)，得樣品 A。將樣品 A，加入 25 mL甲醇(AR)，70℃水浴加熱至全部溶解，趁熱過濾，濾液0℃放置48 h以上，析出白色晶體，過濾，得樣品B。用少量甲醇洗滌晶體。重復(fù)上述過程，重結(jié)晶2次，得樣品C。將C放置烘箱，調(diào)制65℃，烘4 h，得白色粉末狀固體D，稱重;復(fù)烘，直至兩次稱量值差不超過0.001 g。

2.5 甜茶苷的HPLC測(cè)定

對(duì)液相色譜儀進(jìn)行預(yù)處理，先趕氣泡，再用甲醇(LC)和超純水對(duì)色譜柱進(jìn)行梯度洗脫，每一次洗至基線平衡，無峰出現(xiàn)，除去雜質(zhì)。將樣品D溶于超純水(1 mg/mL)，進(jìn)行HPLC分析，以超純水做空白試驗(yàn)，采用內(nèi)標(biāo)法，去除空白樣中溶劑影響而出現(xiàn)雜質(zhì)峰的時(shí)間段，以峰面積(%)換算，得樣品D純度。色譜條件：依利特色譜柱(5 μm，4.6mm ×250 mm);流動(dòng)相為 V(甲醇)：V(水)=65∶35;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，帶寬4 nm，參比360 nm，帶寬1 000 nm;柱溫為30℃。HPLC分析完后，繼續(xù)對(duì)色譜柱進(jìn)行洗柱，先流動(dòng)相洗30 min，再用甲醇洗30 min，至基線平衡。

2.6 甜茶苷的感官審評(píng)

分別稱取 50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg純化過的甜茶苷樣品D溶于250 mL沸水中，冷卻室溫，按溶液濃度高低，審評(píng)其滋味;按溶液甜度分別記“+”，并確定其最佳配比。

3 結(jié)果與分析

3.1 聚酰胺與大孔吸附樹脂的吸附與解析能力比較

由標(biāo)樣可知，質(zhì)量濃度為6.0 g/L的甜茶苷溶液，在13.442 min時(shí)出現(xiàn)所需要的峰，峰面積為2.180e4 mAU·s。

表1 靜態(tài)吸附結(jié)果

表2 靜態(tài)脫附結(jié)果

由表1、2，可以看出，LSA－10大孔吸附樹脂的吸附量(101.652 mg/g)與吸附率(24.203%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于聚酰胺粉的吸附量(29.277 mg/g)與吸附率(6.971%)。顯然，LSA－10大孔吸附樹脂的吸附效果是強(qiáng)于聚酰胺粉的吸附效果的。但對(duì)于二者，選用不同梯度的乙醇對(duì)甜茶苷進(jìn)行解析(解析率：A149.595， A250.005， A361.892， A470.909;B118.770，B240.078，B365.163，B482，281)，縱向上看，都是乙醇濃度越高，解析效果越好。橫向比較，則同一梯度乙醇對(duì)LSA－10大孔吸附樹脂的解析變化強(qiáng)于聚酰胺粉的，且變化趨勢(shì)沒有聚酰胺粉吸附的穩(wěn)定。

3.2 吸附材料對(duì)甜茶苷得率與純度的影響

3.2.1 吸附材料對(duì)高純度甜茶苷樣品D的影響

表3 高純度甜茶苷樣品D的得率

在實(shí)驗(yàn)過程中，LSA－10大孔吸吸附樹脂吸附甜茶苷后，用蒸餾水進(jìn)行解析，但過程中一直無甜味，最終無法收集柱流液，可能是因?yàn)榇朔椒ㄌ幚硐?，LSA－10大孔吸附樹脂的吸附率(24.203)還大于其解析率(18.770)，因而沒辦法將甜茶苷洗脫回收。用25%乙醇進(jìn)行解析，有甜味，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，加甲醇，0℃冷藏，但無結(jié)晶，沒有得出最終產(chǎn)品D。分析原因：①25%乙醇對(duì)LSA－10大孔吸附樹脂進(jìn)行解析，其解析率(40.078%)略強(qiáng)于吸附率(24.203%)，洗脫液有甜味，但樣品不純，脫附劑進(jìn)行解析時(shí)，可能同樣解析出其他物質(zhì)(鞣類物質(zhì)，黃酮類物質(zhì))，導(dǎo)致洗脫液中溶質(zhì)不純不會(huì)析出結(jié)晶體;②脫附劑洗脫時(shí)，洗脫出甜茶苷量少，溶于甲醇后，溶液濃度低于能析出結(jié)晶體的濃度。

由表3可以看出，提取率(A113.000，A218.800，A322.100，A417.233;B319.400，B424.333)最高的是B4處理。橫向比較，聚酰胺粉的純化效果強(qiáng)于LSA－10大孔吸附樹脂的純化效果，不管是蒸餾水還是梯度乙醇都能解析出樣品D。從縱向比較，聚酰胺粉的純化效果和靜態(tài)吸附與脫附實(shí)驗(yàn)比較不成規(guī)律性變化，而LSA－10大孔吸附樹脂的純化只能得出兩組結(jié)果，但相對(duì)符合靜態(tài)吸附與脫附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

3.2.2 不同吸附劑不同洗脫劑對(duì)樣品D純度的影響

表4 不同處理所得樣品D的HPLC分析結(jié)果

除A4D外，其他樣品D的純度均高于標(biāo)樣，證明此實(shí)驗(yàn)中研究方法均可行，特別是聚酰胺的效果強(qiáng)于LSA－10大孔樹脂的效果。而聚酰胺的處理樣，從乙醇濃度梯度來看，25%乙醇效果最好。

3.4 甜茶苷感官審評(píng)結(jié)果與分析

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料，高純度的甜茶苷為極甜無苦味的物質(zhì)。為了驗(yàn)證本研究的純化效果，采用熱水水溶劑法配制不同濃度的甜茶苷溶液。結(jié)果表明：

通過對(duì)不同濃度的甜茶苷溶液進(jìn)行感官審評(píng)，純度較高的甜茶苷的質(zhì)量濃度0.6mg/mL的配比最為適合。這一配比，甜度明顯，但又不會(huì)太過強(qiáng)烈從而掩蓋其他味道。作為一種天然甜味劑，以質(zhì)量濃度0.6mg/mL加入食品中，既不影響原有味道，又有著幽幽的清甜，因而有著良好的發(fā)展前景。

表5 不同濃度甜茶苷感官審評(píng)結(jié)果

4 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)室的一系列研究，可以得出：比較聚酰胺與大孔吸附樹脂的吸附與脫附能力，皆為后者強(qiáng);但比較不同吸附材料處理所得甜茶苷單體的純度，則是聚酰胺所吸附的樣純度高，特別是25%乙醇的處理樣。實(shí)驗(yàn)最終到高純度的甜茶苷單體，證明此方法可獲得高純度的甜茶苷。但如若應(yīng)用于工業(yè)，如考慮將甲醇試劑改用成急性相似的無毒性溶劑。另一方面，從甜茶苷的感官審評(píng)看，其作為食品添加劑——甜味劑的效果也是可行的。

通過本次實(shí)驗(yàn)，閱讀文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)甜茶的研究還是值得深入探討的。如：①將野生的甜茶進(jìn)行選種、育種、馴化，有計(jì)劃的管理和栽培，從而增加產(chǎn)量;②將甜茶的加工工藝中融入傳統(tǒng)茶類的加工方式，制成類茶飲料，從而直接市場(chǎng)銷售，滿足部分消費(fèi)者的需求。

［1］ 張巧云.廣西甜茶中甜茶素及其他化學(xué)成分的研究［D］.桂林：廣西師范大學(xué)，2006.

［2］ 張桂玲，溫四民.甜味植物研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(18) ：4712 －4713.

［3］ 陳全斌，張巧云，義祥輝.高純度甜茶甙的制備［J］.林業(yè)科技，2006(7)4：55 －56.

［4］ 吳金嬌，陳全斌.甜茶甙甜味特性的研究［J］.試驗(yàn)報(bào)告與理論研究，2008，11(9)：14 －15.

［5］ 何偉平.天然甜味劑——甜茶苷的工藝化實(shí)驗(yàn)［J］.廣西輕工業(yè)，1991(1)：1 －5.

［6］ 周如金，黃敏，張玲，等.大孔吸附樹脂提取甜茶苷的研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2008，28(5)：35 －39.

Study on Extraction of Rubusoside from Rubus suavissimus S.Lee by Column Purification

Ge Yiyin，Zhang Lingyun
(College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

This experiment takes the standardized Extracts of Rubus suavussumus S.Lee that containing 70%Rubusoside as the raw material.Silica gel column chromatography and crystallization are simple and available methods to isolate Rubusoside.We use these methods in order to get some high purity Rubusoside.In column adsorptive purification，we use the polyamide and Styrene LSA －10 as the adsorbing material.And we use the ethanol of different volume concentration to elution.According to the conclusion of these experiments，the adsorptive capacity and the resolving power of Styrene LSA －10 are better than that of polyamide.But，comparing with different adsorption materials deal，the polyamide get the high purity，especially 25%ethanol processing samples.

Rubusoside;column purification;polyamide and Styrene LSA－10;HPLC

S566.9

A

1006－9690(2012)05－0033－04

10.3969/j.issn.1006－9690.2012.05.0009

2012－03－18

葛益銀(1987－)，女，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀研究生。研究方向：園藝植物的加工與綜合利用。E－mail：gyyag@126.com

導(dǎo)師簡(jiǎn)介：張凌云，男，副教授。E－mail：lingyunzh@163.com