齊向英，奚增軍，陳宗禮，張向前，李志強(qiáng)，任 寬

(陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延安大學(xué))延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000)

木棗試管苗葉片POD同功酶特性研究

齊向英，奚增軍，陳宗禮*，張向前，李志強(qiáng)，任 寬

(陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延安大學(xué))延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000)

以木棗試管苗葉片為材料，以愈創(chuàng)木酚為底物，研究其POD同功酶動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明：木棗試管苗葉片POD同功酶酶促反應(yīng)的最適pH值為5.0，最適溫度范圍為42～46℃之間，Km值為40.66mmol/L，Vmax值為673.6U/s·gFW。在H2O2濃度為0.4%的反應(yīng)體系中，反應(yīng)3～18 min內(nèi)測(cè)定酶活可獲得較好的結(jié)果。

木棗;試管苗;葉片;POD同功酶

棗(Zizupus jujube Mill.) 是我國(guó)特有植物［1］，《中國(guó)果樹志·棗卷》記載我國(guó)有棗樹品種700多個(gè)。由于棗樹具有耐澇、耐寒、耐貧瘠等特點(diǎn)，所以一直被譽(yù)為“鐵桿莊稼”。棗樹這些特性和其體內(nèi)的酶系統(tǒng)是分不開的。過(guò)氧化物酶(POD)是一種底物較為廣泛的氧化酶類，在高等植物中廣泛而大量地存在著［2］。棗樹過(guò)氧化物酶研究已有報(bào)道，但其主要研究集中在用過(guò)氧化物酶作系統(tǒng)分類［3－6］、棗樹病變和酶變化的關(guān)系研究［7］、水分脅迫對(duì)酶活的影響分析［8］、酶活不同時(shí)期的變化［9］等方面。有關(guān)棗樹過(guò)氧化物酶特性和動(dòng)力學(xué)的研究一直未見報(bào)道。本研究從木棗試管苗葉片中提取棗樹POG同功酶，并對(duì)該酶的特征、動(dòng)力學(xué)參數(shù)做了研究，以其為試管生態(tài)條件下棗樹體內(nèi)POD同功酶的合理調(diào)控提供依據(jù)，同時(shí)為棗樹POD同功酶在其它生態(tài)條件下的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用材料為木棗繼代培養(yǎng)的試管苗，按延志蓮［10］等方法將木棗試管苗繼代培養(yǎng)30d，取其由頂向下的第2、3片展開的葉子作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 酶液粗提 稱取棗樹試管苗葉片1 g，加2 mL樣品提取液于預(yù)冷研缽中，在冰浴中研磨，并分3次共用8 mL樣品提取液清洗研缽。粗提酶液于4℃、8 000 r/min、離心10 min，上清液即為酶液。將粗提酶液在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶活測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行測(cè)定。在試管中加入1 mL的酶液、1 mL 0.4%的愈創(chuàng)木酚和1 mL pH=6的磷酸緩沖液，搖勻后置于30℃水浴中預(yù)熱5 min，然后快速加入1 mL蒸餾水，并開始計(jì)時(shí)，立即用紫外—可見分光光度計(jì)測(cè)定1 min內(nèi)△OD470。在實(shí)驗(yàn)組試管中加入1 mL的酶液、1 mL的愈創(chuàng)木酚和1 mL磷酸緩沖液，搖勻后置于30℃水浴中預(yù)熱5 min，然后快速加入1 mL H2O2，并開始計(jì)時(shí)，立即用紫外—可見分光光度計(jì)(島津UV－1601)測(cè)定1min內(nèi)△OD470。一個(gè)酶活單位為每克鮮重樣在1 s內(nèi)使OD值升高0.1(以u(píng)nit/s·g FW表示)。

1.4 POD同功酶最適pH值測(cè)定

在不同pH值的緩沖液中測(cè)定酶液活性，確定POD同功酶最適pH值。pH值的范圍從pH 2.0～12.0，每隔0.5個(gè)單位梯度進(jìn)行測(cè)定，溫度30℃，重復(fù)測(cè)定3次。以最大活性管的值為100%，計(jì)算其相對(duì)活性。

1.5 POD同功酶最適溫度的測(cè)定

在pH 4.6的條件下，在10～100℃范圍內(nèi)每隔2℃，測(cè)定酶液POD同功酶的活性，確定其最適溫度。以最大活性管的值為100%，計(jì)算其相對(duì)活性。

1.6 H2O2對(duì)POD同功酶活性的影響的測(cè)定

設(shè)置 H2O2的濃度分別為 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%(v/v)，在其它條件相同的情況下測(cè)定POD同功酶的活性，以最大活性管的值為100%，計(jì)算其相對(duì)活性。

1.7 POD的Km值和Vmax值的測(cè)定

以愈創(chuàng)木酚為底物，設(shè)置 4、10、12、14、16、18、20 mmol/L的底物濃度，在pH 5.0，30℃條件下分別測(cè)定POD活性。用Lineweaver－Burk的雙倒數(shù)法［10］進(jìn)行曲線回歸計(jì)算，求得Km值和Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)木棗試管苗葉片POD同功酶活性的影響

一般情況下酶的活性隨反應(yīng)體系pH值的變化而變化，在某一pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出酶的最高活性，這個(gè)pH稱為酶的最適pH。木棗試管苗葉片POD酶活性研究結(jié)果表明(見圖1)，木棗試管苗葉片POD酶活在pH為5.0是的活性最大。以pH為5.0時(shí)的POD酶活為100%，在pH＞7.0或者pH＜3.0時(shí)約有50%的POD酶活性被抑制，pH＞8.5時(shí)約有80%的POD酶活性被抑制。在3.5＜pH ＜5.0或者5.0＜pH ＜7.0之間約有20%的POD酶活性被抑制。

圖1 pH對(duì)木棗試管苗葉片POD同功酶活性的影響

2.2 H2O2值對(duì)木棗試管苗葉片POD同功酶活性的影響

在植物體內(nèi)，POD同功酶可以催化H2O2的分解，在一定量的過(guò)氧化氫下，POD同功酶能夠發(fā)揮較大的催化作用，當(dāng)H2O2超過(guò)一定的濃度，POD的活性就會(huì)降低(見圖2)。木棗試管苗葉片POD酶活性研究結(jié)果表明，在H2O2濃度為0.4%的反應(yīng)體系中，木棗試管苗葉片POD同功酶的活性最大。以H2O2濃度為0.4%時(shí)的POD酶活為100%，在反應(yīng)體系中0.1% ＜H2O2＜0.4%或者0.4% ＜H2O2＜0.8%的反應(yīng)體系中由20%的酶活性被抑制，在反應(yīng)體系中0.8% ＜H2O2＜1.6%的反應(yīng)體系中約有40%的酶活性被抑制。

圖2 H2O2對(duì)木棗試管苗POD同功酶活性的影響

2.3 溫度對(duì)木棗試管苗葉片POD同功酶活性的影響

一般情況下，隨溫度的升高酶的活性會(huì)增加，當(dāng)溫度升的某一范圍時(shí)，酶的活性達(dá)到最大值，這是的溫度稱為酶促反應(yīng)的最適溫度。如果溫度繼續(xù)增加酶的活性就會(huì)降低。木棗試管苗葉片POD酶活性研究結(jié)果表明(見圖3)，在反應(yīng)體系的溫度為42℃～46℃時(shí)木棗試管苗葉片POD同功酶的活性達(dá)到最大值，以這一溫度范圍的值為100%。在溫度為28℃ ＜T＜40℃或者48℃ ＜T＜52℃的范圍內(nèi)約有20%的POD酶活性被抑制;在溫度為18℃ ＜T＜26℃或者54℃ ＜T＜70℃范圍內(nèi)約有40%的POD酶活性被抑制;但在反應(yīng)體系為2℃ ＜T＜74℃范圍內(nèi)均能表現(xiàn)出40%的酶活。

圖3 溫度對(duì)木棗試管苗葉片POD同功酶活性的影響

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)木棗試管苗葉片POD同功酶活性的影響

反應(yīng)時(shí)間顯示的酶促反應(yīng)的快慢，通過(guò)對(duì)木棗試管苗葉片POD同功酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，隨反應(yīng)時(shí)間的增加酶活顯示出先增加，后減低的趨勢(shì)(圖4)。測(cè)定結(jié)果顯示在反應(yīng)的6～7 min，木棗試管苗葉片POG同功酶活達(dá)到最大值，在反應(yīng)4～10 min內(nèi)測(cè)定木棗試管苗葉片POD同功酶活性可得到較好的結(jié)果。反應(yīng)時(shí)間小于3 min或者大于18 min不適合木棗葉片POD同功酶活性的測(cè)定。

圖4 反應(yīng)時(shí)間多木棗試管苗POD同功酶活性的影響

2.5 木棗試管苗葉片POD同功酶酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax

當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，酶促反應(yīng)速度與底物濃度成正比，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定限度時(shí)，所有酶全部與底物結(jié)合，反應(yīng)速度達(dá)到最大值(Vmax)。米氏常數(shù)Km表示酶與底物親和力的大小，它相當(dāng)于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，其倒數(shù)被稱為親和力常數(shù)。利用雙倒數(shù)法對(duì)1/［S］和1/V作圖(圖5)并進(jìn)行一元線性回歸，計(jì)算出木棗試管苗葉片POD同功酶以愈創(chuàng)木酚為底物的Km值為40.66mmol/L，Vmax值為 673.6U/s·g FW。說(shuō)明木棗試管苗POD同功酶與愈創(chuàng)木酚的親和力較好。

圖5 木棗試管苗POD同功酶酶促反應(yīng)雙倒數(shù)曲線

3 討論

實(shí)驗(yàn)表明木棗試管苗葉片POD同功酶酶促反應(yīng)的最適pH值為5.0，最適溫度范圍為42～46℃之間。馮曉霞等［11］以石榴果皮為材料的研究結(jié)果顯示以愈創(chuàng)木酚為底物時(shí)，最適pH值為6.5，最適溫度為40℃反應(yīng)時(shí)間不宜超過(guò)15 min，底物濃度宜大于0.03 mol/L，反應(yīng)完成后在40 min內(nèi)測(cè)定POD的活性最為穩(wěn)定。時(shí)忠杰［12］等對(duì)板栗葉片POD的研究表明其最適pH為4.6，最適溫度為38℃，最適H2O2濃度為0.1%，Km值為128.17 mmol/L，Vmax值為281.68 U/(s·gFW)。田呈瑞［13］在以經(jīng)清洗后去皮去核的新鮮芒果為材料研究發(fā)現(xiàn)芒果POD同功酶最適pH值為4.75，在75℃下加熱處理20 min或50℃下處理5 min，可使過(guò)氧化物酶完全失活。謝永紅等［14］以錦橙成熟春梢葉片提取過(guò)氧化物酶(POD)，測(cè)定發(fā)現(xiàn)其最適pH為5.0，最適溫度為32℃。李建芳等［15］以新鮮魚腥草根部為材料的研究結(jié)果表明魚腥草POD的最適pH值為7.0、最適溫度為45℃。這說(shuō)明雖然POD同功酶是植物體內(nèi)存在廣泛的酶類，但因物種的不同POD同功酶的最適pH和溫度也不一定相同。偏離最適溫度和pH值酶的活性將受到很大的影響。本實(shí)驗(yàn)中H2O2的濃度為0.4%的反應(yīng)體系中測(cè)定木棗試管苗葉片POD同功酶活性較好。測(cè)定的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該控制在3～18 min之間。以愈創(chuàng)木酚為底物通過(guò)一元回歸測(cè)定得到木棗試管苗葉片POD同功酶的Km值為40.66mmol/L，Vmax值為673.6U/s·gFW。這與上述學(xué)者在其他物種上的研究也有所不同。木棗試管苗葉片和其它底物結(jié)合的最適溫度范圍、最適pH值、Km值和Vmax值是否與其有同樣的趨勢(shì)還有待進(jìn)一步研究。

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Studies on Peroxidase Activities with in vitro Leaves of Chinese Jujube，Mu Zao

Qi Xiangying，Xi Zengjun，Chen Zongli，Zhang，Xiangqian，Li Zhiqiang，Ren Kuan
(Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube(Yanan University)College of Life Science，Yan＇an University，Yan＇an 716000，China)

Study on POD isozymes of Chinese Jujube，with the test tube seedling leaves of Muzao，Guaiacol as substrate.The results show that：the optimum pH for leaves of Muzao POD isoenzyme in enzymatic reactions of is 5;the optimum temperature range between 42－46℃;the value of Km is 40.66mmol/L;the value of Vmax is 673.6U/s g FW.In H2O20.4%concentration in the reaction system，reaction 3 －18 min determination of endogenous enzyme activity can obtain better results.

Muzao;in vitro plant;leaves;peroxidase

Q945

A

1006－9690(2012)05－0020－04

10.3969/j.issn.1006－9690.2012.05.0005

2012－03－06

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009JM3001－3);陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)(05JS39);延安大學(xué)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(YD2011－145)

齊向英(1980－)，男，陜西寶雞人，講師，碩士，研究方向：植物生物技術(shù)與植物遺傳育種。E－mail：yd_qixiangying@163.com

*通訊作者：陳宗禮(1954－)，男，陜西扶風(fēng)人，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：植物組織培養(yǎng)與植物遺傳育種。E－mail：zongli_chen@yahoo.com.cn