廖祥茹，陳 晨，鄭漢平，劉祖雄

(中國人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430070)

復(fù)方丙酸倍氯米松乳膏為醫(yī)院制劑，含有丙酸倍氯米松、氯霉素等成分，臨床用于過敏性與炎癥性皮膚病和相關(guān)疾病。根據(jù)2010年版《中國藥典(二部)》[1]，采用薄膜過濾法對其進行細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的驗證以及控制菌金黃色葡萄球菌的檢查，采用培養(yǎng)基稀釋法對控制菌銅綠假單胞菌進行檢查。報道如下。

1 儀器與材料

HTY－2000型集菌儀、可拆卸式薄膜過濾器(杭州高得醫(yī)療器械有限公司);微孔濾膜(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司，孔徑0.45μm);SW－CJ－IFD/T型潔凈工作臺、BSC－1300ⅡA2型生物安全柜(蘇凈集團安泰公司);PYX－DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進醫(yī)療器械廠);SPX－250B－Z型生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。復(fù)方丙酸倍氯米松乳膏(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科制劑室，規(guī)格為30 g，批號分別為20110822，20111212，20120217)。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，均由北京三藥科技有限公司生產(chǎn)，為符合藥典規(guī)定的干燥培養(yǎng)基。0.9%無菌氯化鈉溶液，按2010年版《中國藥典(二部)》附錄方法配制。大腸埃希菌[CMCC(B)44102]第4代、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]第4代、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]第4代、白色念珠菌[CMCC(F)98001]第3代、黑曲霉[CMCC(F)98003]第4代、銅綠假單孢菌[CMCC(B)10104]第3代，均由湖北省藥監(jiān)所提供。

2 方法

2.1 菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24 h，分別取上述培養(yǎng)物1mL，加0.9%的無菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋制成每1mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，置23～28℃下培養(yǎng)24～48 h，取培養(yǎng)物1 mL，加入無菌0.9%氯化鈉注射液9mL中，10倍遞增稀釋制成每1mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液;接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置23～28℃下培養(yǎng)5～7 d，加入5mL含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，取原液1mL，加入含0.05%(V/V)聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉注射液9mL中，10倍遞增稀釋制成每1mL含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試液制備

取樣品5 g，加至熔化的(溫度不超過45℃)含2.5 g司盤80、5 g聚山梨酯80無菌混合物的錐形瓶中，用無菌玻棒攪拌成團后，分次加入45℃無菌0.9%氯化鈉注射液至100mL，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，振搖均勻。作為1∶20供試液，備用。

2.3 菌落計數(shù)方法的驗證

2.3.1 平皿法、培養(yǎng)基稀釋法

試驗組:取1∶20供試液2mL，0.5mL和各試驗菌液(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)1mL，分別注入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，分別置30～35℃下培養(yǎng)3 d和23～28℃下培養(yǎng)5 d，按平皿法測定其菌數(shù)。

菌液組:分別取上述稀釋的試驗菌液1mL注入平皿內(nèi)，每種試驗菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數(shù)。

供試品對照組:取1∶20供試液2mL和0.5mL，按照試驗組方法操作，不加菌液，測定供試品的本底菌數(shù)。

稀釋劑對照組:取稀釋劑1mL按照試驗組操作。

結(jié)果見表1和表2。可見，平皿法和培養(yǎng)基稀釋法3次試驗5株菌株均不同程度受到了抑制，說明常規(guī)平皿法和培養(yǎng)基稀釋法均不能有效去除其抑菌成分，須重新建立細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證。

2.3.2 薄膜過濾法

試驗組:取1∶20供試液20mL，按10mL/膜，加入含100mL稀釋液的薄膜過濾器中全量過濾，用沖洗液沖洗400 mL。最后1次加入1mL(50～100 cfu)各試驗菌，取出濾膜菌面朝上貼于已制備的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，平行制備2皿，置30～35℃下培養(yǎng)3 d或23～28℃下培養(yǎng)5 d。逐日觀察，按平皿法測定其菌數(shù)。

菌液組:分別取上述試驗菌液1mL注入薄膜過濾器內(nèi)過濾，貼膜。每種菌平行制備2張濾膜，分別測定所加的試驗菌數(shù)。

供試品對照組:取1∶20供試液20 mL按照試驗組方法操作，不加菌液，測定樣品本底數(shù)。

稀釋劑對照組:取稀釋劑1mL按照試驗組方法操作。重復(fù)試驗3次。

結(jié)果見表3?？梢姡?00 mL沖洗時，各試驗菌株的回收率均達到70%以上。說明薄膜過濾法可用于復(fù)方丙酸倍氯米松乳膏的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)，沖洗量定為400mL。

表1 常規(guī)平皿法回收率測定結(jié)果(%)

表2 薄膜過濾法回收率測定結(jié)果(%)

表3 控制菌銅綠假單胞菌驗證結(jié)果

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 銅綠假單胞菌檢查方法的驗證

試驗組:取1∶20的供試液20mL及1mL銅綠假單胞菌菌液，接種至200mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基內(nèi)，于35℃培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24 h，依相應(yīng)控制菌檢查法進行檢查。

陰性菌對照組:取1∶20的供試液20mL及1mL大腸埃希菌菌液，接種至200mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基內(nèi)，按試驗組方法操作。

結(jié)果，試驗組檢出銅綠假單胞菌，陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌。說明200mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基可用于復(fù)方丙酸倍氯米松乳膏銅綠假單胞菌的檢查。

2.4.2 金黃色葡萄球菌檢查方法的驗證

試驗組:取1∶20的供試液20mL，按10mL/膜，加入含100mL稀釋液的薄膜過濾器中全量過濾，用沖洗液沖洗400mL。取出濾膜加至100mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，加入1mL金黃色葡萄球菌菌液，于35℃下培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)物，劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24～72 h，依相應(yīng)控制菌檢查法進行檢查。

陰性菌對照組:取1∶20的供試液20mL及1mL大腸埃希菌菌液，按試驗組方法操作。

結(jié)果見表4，試驗組檢出了金黃色葡萄球菌，陰性菌對照組未檢出大腸埃希菌。說明薄膜過濾法(沖洗量400mL)可用于復(fù)方丙酸倍氯米松乳膏金黃色葡萄球菌的檢查。

表4 控制菌金黃色葡萄球菌驗證結(jié)果

3 討論

在驗證過程中，筆者曾試驗多種供試液制備方法，最終采用了文中所述方法，該法制備的供試液較易通過濾膜，且回收率比其他方法理想。

稀釋劑對照組的菌回收率均大于70%，說明采用含適量聚山梨酯80，司盤80的0.9%無菌氯化鈉溶液作為稀釋液對試驗不產(chǎn)生干擾。

控制菌銅綠假單胞菌檢查采用培養(yǎng)基稀釋法;在控制菌金黃色葡萄球菌的檢查中，培養(yǎng)基稀釋法未能有效檢出陽性菌，故采用薄膜過濾法，沖洗后取出濾膜加至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:附錄 107－116.