焦自明，高 冉，楊建雄，，*，郭 琦，戴晶晶，陳 蓓，馬兆瑞

（1.陜西師范大學(xué)物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院，陜西西安 710062；2.陜西師范大學(xué)新聞與傳播學(xué)院，陜西西安710062；3.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062；4.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

從茶渣中提取茶多糖工藝條件的優(yōu)化研究

焦自明1，高 冉2，楊建雄1，3，*，郭 琦1，戴晶晶4，陳 蓓3，馬兆瑞3

（1.陜西師范大學(xué)物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院，陜西西安 710062；2.陜西師范大學(xué)新聞與傳播學(xué)院，陜西西安710062；3.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062；4.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

以低檔茶葉提取茶多酚后的茶渣為原料，研究茶葉多糖的水提工藝及初步純化技術(shù)。分別就提取過(guò)程中的料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度、浸提次數(shù)進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，并用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，用醇沉及脫蛋白技術(shù)對(duì)茶多糖進(jìn)行初步純化，得出優(yōu)化的工藝為：料液比1∶30，浸提溫度85℃，浸提時(shí)間2h，浸提次數(shù)3次，濃縮液與95%乙醇用量1∶5，乙醇沉淀靜止6h，Sevage法脫蛋白3次，茶多糖的得率為4.10%。

茶渣，茶多糖，優(yōu)化

Abstract：The water extraction and preliminary purification technology of tea polysaccharide（TPS） was studied.Main factors of extraction technology such as material-to-liquid ratio，extraction time，extraction temperature，and number of extraction times were researched through single-factor experiments.The optimum extraction technology was confirmed through orthogonal test of L9（34）.The preliminary purification technologies of alcohol precipitation and deproteintion on tea polysaccharide were investigated.The optimal conditions were as follows：the ratio of material to liquid was 1∶30，extraction temperature was 85℃，extraction time was 2h for three times，ratio of concentrated solution to 95%alcohol was 1∶5，alcohol quiescence time was 6h，and the protein was removed with Sevage method for 3 times.Under these conditions，the final polysaccharide yield was 4.10%.

Key words：tea residues；tea polysaccharide；optimization

我國(guó)茶飲料年產(chǎn)量已超過(guò)700萬(wàn)t，每年會(huì)產(chǎn)生大量的茶渣，但是我國(guó)目前對(duì)茶渣的回收利用還處于初步研究階段。茶渣中含有較豐富的可溶性多糖，茶多糖是繼茶多酚之后發(fā)現(xiàn)的又一重要生理活性物質(zhì)，具有降血糖[1]、降血脂[2]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[3]、抗癌抗輻射、降血壓、減慢心率、增加冠脈流量、抗凝血、抗血栓和抗氧化等作用[4-6]。隨著對(duì)多糖研究的日益深入，特別是發(fā)現(xiàn)茶葉水溶性組分中的多糖復(fù)合物是茶葉中主要的降血糖成分[7]以后，茶多糖的提取、分離純化、分析檢測(cè)等方面研究越來(lái)越引起人們的關(guān)注，茶多糖的提取方法主要有水浸提法[8-9]、超濾法提取[10]，酶法輔助提取[11]、微波輔助提取[12]及超聲波輔助提取[13]。超濾提法、酶提法、微波提法和超聲波提法對(duì)提取條件要求較高，而且成本較高，因此在實(shí)際生產(chǎn)加工中仍以水提法為主。有關(guān)茶多糖的水提法提取工藝的研究，國(guó)內(nèi)有一些報(bào)道，國(guó)外較少。我國(guó)年產(chǎn)成品茶約60萬(wàn)t，其中低檔粗老茶約10萬(wàn)t。而隨著人民生活水平的提高，粗老茶愈來(lái)愈無(wú)人問(wèn)津，除一部分粗老茶葉被用于制備茶飲料外，大量粗老茶葉被用作肥料或燃料，造成自然資源的大量浪費(fèi)。據(jù)報(bào)道茶葉越粗老，多糖含量越高[14]，但未見(jiàn)從茶渣中提取分離茶多糖的研究，本實(shí)驗(yàn)用低檔茶提取茶多酚后茶渣提取可溶性多糖，不僅有利于茶葉資源的充分利用，提高經(jīng)濟(jì)效益，而且為茶渣再利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶渣 用低檔紫陽(yáng)富硒茶醇法提取茶多酚制備；標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白 美國(guó)Sigma公司；乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、磷酸、考馬斯亮藍(lán)G250、氯仿、正丁醇 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TU1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CF16RX高速離心機(jī) 日本日立公司；E-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Alpha 4真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；磁力攪拌器，恒溫水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶多糖水提法工藝流程 紫陽(yáng)富硒茶→醇法提取茶多酚→殘?jiān)?0℃烘干至恒重→熱水提取→濃縮→醇沉→收集沉淀→復(fù)溶→Sevage法脫蛋白→醇沉→復(fù)溶→流水透析3d→冷凍干燥→茶多糖粗品

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 采用水提法提取茶多糖，分別就料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間、浸提次數(shù)等做單因素實(shí)驗(yàn)。并按下式計(jì)算茶多糖的提取率：茶多糖提取率（%）=（多糖質(zhì)量/樣品質(zhì)量）×100

1.2.2.1 料液比 準(zhǔn)確稱取茶渣1.000g，固定浸提溫度80℃，浸提時(shí)間2.5h，浸取次數(shù)1次，研究不同的料液比（g/mL）1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45對(duì)茶多糖提取率的影響。

1.2.2.2 浸提時(shí)間 準(zhǔn)確稱取茶渣1.000g，固定浸提溫度80℃，浸取次數(shù)1次，采用以上選出的結(jié)果，研究提取時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h對(duì)茶多糖提取率的影響。

1.2.2.3 浸提溫度 準(zhǔn)確稱取茶渣1.000g，固定浸取次數(shù)1次，采用以上選出的結(jié)果，研究茶渣在45、55、65、75、85、95℃條件下茶多糖的提取率。

1.2.2.4 浸提次數(shù) 準(zhǔn)確稱取茶渣1.000g，其他條件采用以上選出的結(jié)果，研究不同浸提次數(shù)1、2、3、4次條件下茶多糖的提取率。

1.2.3 茶多糖提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[15]本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從前面對(duì)茶多糖浸提影響因素的考察中，我們選擇了以下料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間以及浸提次數(shù)為影響因素進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。

表1 茶多糖提取工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Design of the orthogonal test of extracting tea polysaccharide

1.2.4 乙醇沉淀茶多糖實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 乙醇用量 浸提液濃縮至原體積的1/4，選用乙醇做沉淀劑，固定靜置時(shí)間為10h，研究不同的乙醇加入量（即浸提液與95%乙醇的體積比分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8）對(duì)茶多糖沉淀率的影響。并按下式計(jì)算茶多糖的沉淀率：茶多糖沉淀率（%）=（凍干后得到的樣品中多糖質(zhì)量/沉淀前溶液中的多糖質(zhì)量）×100

1.2.4.2 靜置時(shí)間 浸提液濃縮至原體積的1/4，選用乙醇做沉淀劑，采用以上選出的結(jié)果，研究靜置時(shí)間2、4、6、8、10、12h對(duì)茶多糖沉淀率的影響。

1.2.5 Sevage法脫蛋白次數(shù)對(duì)茶多糖中糖和蛋白含量的影響 對(duì)醇沉后所得粗多糖，用適量的蒸餾水溶解，然后分成7份，多糖溶液中加入0.25倍體積的Sevage試劑，充分振蕩后（3000r/min）離心15min，蛋白質(zhì)與Sevage試劑形成凝膠，即可除去。分別采取脫除1、2、3、4、5、6、7次，并計(jì)算粗多糖中的蛋白含量（Sevage試劑：氯仿∶正丁醇=4∶1）。并按下式計(jì)算茶多糖的損失率和蛋白的去除率：茶多糖損失率（%）=（除蛋白后多糖的損失量/除蛋白前的多糖質(zhì)量）×100；蛋白去除率（%）=（除蛋白后多糖中蛋白的損失量/除蛋白前多糖中蛋白的含量）×100

1.2.6 茶多糖和茶蛋白的相關(guān)性研究 茶多糖的正交實(shí)驗(yàn)中測(cè)定茶多糖含量的同時(shí)對(duì)茶蛋白進(jìn)行同步測(cè)定，研究?jī)烧咧g的相關(guān)性。按下式計(jì)算茶蛋白的提取率：茶蛋白提取率（%）=（蛋白質(zhì)量/樣品質(zhì)量）×100

1.2.7 茶多糖中糖和蛋白含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[16]，多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸比色法[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)茶多糖提取率的影響 由圖1可知，茶多糖的提取率隨著料液比的增加而升高，但達(dá)到1∶35后茶多糖提取率上升緩慢，故料液比選擇1∶35為宜。

圖1 料液比對(duì)茶多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ratio of solid to liquid on the extracting ratio of tea polysaccharide

2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響 由圖2可知，2.5h的時(shí)候提取率達(dá)到最高值3.03%，提取時(shí)間宜取2.5h。

2.1.3 浸提溫度對(duì)茶多糖提取率的影響 由圖3可知，浸提溫度低于75℃，茶多糖提取率隨溫度緩慢升高，75℃以后增加迅速。但用85℃以上熱水浸提，會(huì)破壞降血糖有效成分[14]，所以提取溫度不宜高于85℃。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extracting time on the extracting ratio of tea polysaccharide

圖3 浸提溫度對(duì)茶多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on the extracting ratio of tea polysaccharide

2.1.4 浸提次數(shù)對(duì)茶多糖提取率的影響 由圖4可知，提取率隨著浸提次數(shù)的增加而上升，但增加幅度逐漸降低。浸提4次多糖的提取率僅比浸提3次多糖提取率多0.59%，考慮到提取時(shí)要維持85℃較高的溫度，以及后續(xù)濃縮、醇沉、脫蛋白等工藝條件的耗能耗材，成本已經(jīng)大于收益，為了降低成本、提高效率、節(jié)約能源，并兼顧得率，浸提次數(shù)選取3次。

圖4 浸提次數(shù)對(duì)茶多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extracting times on the extracting ratio of tea polysaccharide

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可知，四個(gè)因素對(duì)茶多糖提取率的影響大小為：D＞B＞C＞A。其最佳提取參數(shù)是A2B3C3D3，但由于料液比和浸提時(shí)間為次要因素，為節(jié)約時(shí)間和成本，調(diào)整料液比為1∶30，浸提時(shí)間為2h，則組合方案為A1B3C1D3，與A1B3C3D3同時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證，在A1B3C3D3的工藝條件下，茶多糖提取率5.34%，略高于A1B3C1D3條件下提取率5.22%。但從節(jié)省能源、成本、時(shí)間的角度考慮選擇A1B3C1D3，即料液比為1∶30，浸提溫度為85℃，浸提時(shí)間為2h，浸提次數(shù)為3次。

將正交實(shí)驗(yàn)所得的粗多糖中茶多糖和茶蛋白的含量進(jìn)行相關(guān)性分析得；相關(guān)系數(shù)r=0.94，表明茶多糖含量和茶蛋白含量呈正相關(guān)，這極有可能是因?yàn)橐徊糠值鞍资且蕴请幕蛱堑鞍椎男问酱嬖诘?，而這部分糖蛋白并非雜質(zhì)，而且極有可能對(duì)其功能有重要貢獻(xiàn)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of design of the orthogonal test

2.3 乙醇沉淀茶多糖實(shí)驗(yàn)

2.3.1 乙醇用量對(duì)沉淀率的影響 由圖5可知，沉淀率隨著乙醇用量的加大而增加，但在1∶5至1∶6之間多糖沉淀率增長(zhǎng)十分緩慢，比較而言，濃縮液與95%乙醇用量取1∶5為宜。

圖5 乙醇用量對(duì)多糖沉淀率的影響Fig.5 The consumption rate of ethanol has effect on the precipitation rate of polysaccharide

2.3.2 靜置時(shí)間對(duì)多糖沉淀率的影響 由圖6可知，在靜置6h之后沉淀率可達(dá)到最大值89.52%，因此乙醇沉淀的靜置時(shí)間選6h最佳。

2.4 Sevage法脫蛋白次數(shù)對(duì)茶多糖中糖和蛋白含量的影響

由圖7可知，隨著Sevage法脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)的去除率上升，但是茶多糖的損失率也在增加。經(jīng)過(guò)7次脫蛋白，蛋白的去除率達(dá)到52.49%，但是在第三次蛋白的去除率就已經(jīng)達(dá)到51.05%，這時(shí)茶多糖的損失率是10.94%，因此，脫蛋白選擇3次為宜。

Sevage法脫蛋白4到7次，茶多糖中蛋白含量不再變化，這很可能是因?yàn)檫@部分蛋白質(zhì)與糖鏈結(jié)合在一起，以糖肽或糖蛋白的形式存在。

圖7 脫蛋白次數(shù)與蛋白去除率及多糖損失率的關(guān)系Fig.7 The relationship between the times of removing protein and the removal rate of protein or the loss rate of polysaccharide

3 結(jié)論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究得出從生產(chǎn)茶多酚后的中低檔茶渣中提取茶多糖的的最優(yōu)工藝為：料液比1∶30，浸提溫度85℃，浸提時(shí)間2h，浸提次數(shù)3次，此時(shí)提取率可達(dá)到5.22%；并得出初步純化的最優(yōu)條件為：濃縮液與95%乙醇用量1∶5，乙醇沉淀靜止6h，Sevage法脫蛋白3次。經(jīng)過(guò)濃縮、醇沉、脫蛋白三個(gè)步驟后，最終提取率為4.10%，多糖含量為59.72%，蛋白含量為6.88%。

粗多糖中茶多糖和茶蛋白的含量相關(guān)系數(shù)為r=0.94，表明茶多糖含量和茶蛋白含量呈正相關(guān)，且Sevage法脫蛋白不能將蛋白除盡，這極有可能是因?yàn)橐徊糠值鞍资且蕴请幕蛱堑鞍椎男问酱嬖?，而這部分糖蛋白并非雜質(zhì)，極有可能對(duì)其功能有重要貢獻(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)的研究同時(shí)也為茶渣的綜合利用以及工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)，為將茶渣變廢為寶，解決茶渣對(duì)環(huán)境造成污染問(wèn)題開(kāi)辟一個(gè)新途徑。

[1]陳建國(guó)，王茵，梅松，等.茶多糖降血糖、改善糖尿病癥狀作用的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2003，25（3）：253-255.

[2]王丁剛，王淑如.茶葉多糖的分離、純化、分析及降血脂作用[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，22（4）：225-228

[3]付書(shū)婕，王乃平，黃仁彬.植物多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（1）：99-101.

[4]Nie S P，Xie M Y.A review on the isolation and structure of tea polysaccharides and their bioactivities[J].Food Hydrocolloids，2011，25（2）：144-149.

[5]Guo L，Du X F，Lan J，et al.Study on molecular structural characteristics of tea polysaccharide[J].International Journal of Biological Macromolecules，2010，47（2）：244-249.

[6]Chen H X，Zhang M，Xie B J.Components and antioxidant activity of polysaccharide conjugate from green tea[J].Food Chemistry，2005，90（1-2）：17-21.

[7]Chen X Q，Lin Z，Ye Y，et al.Suppression of diabetes in non-obese diabetic（NOD） mice by oral administration of watersoluble and alkali-soluble polysaccharide conjugates prepared from green tea[J].Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：28-33.

[8]王黎明，夏文水.水法提取茶多糖工藝條件優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2005，26（5）：171-174.

[9]黃杰，孫桂菊，李恒，等.茶多糖提取工藝研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，127（6）：77-79.

[10]劉軍海.超濾法提取茶多糖研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（9）：124-126.

[11]劉育玲，姚開(kāi)，賈冬英，等.茶多糖酶法提取的優(yōu)化條件及其對(duì)葡萄糖激酶活性的影響[J].食品科技，2010，35（2）：134-137.

[12]聶少平，謝明勇，羅珍.微波技術(shù)提取茶多糖的研究[J].食品科學(xué)，2005，26（11）：103-107.

[13]黃永春，馬月飛，謝清若，等.超聲波輔助提取茶多糖及其分子量變化的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（7）：170-173.

[14]傅博強(qiáng)，謝明勇，周鵬.茶葉多糖的提取純化、組成及藥理作用研究進(jìn)展[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：理科版，2001，25（4）：358-363.

[15]潘麗軍，陳錦權(quán).實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M].南京：東南大學(xué)出版社，2008：104-105.

[16]朱成文，白同春，劉德啟，等.硫酸苯酚法與焦糖化分光光度法相結(jié)合測(cè)定藻類水溶液中總糖濃度[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，21（2）：63-67.

[17]楊建雄.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程[M].第2版.北京：科學(xué)出版社，2009：35-36.

Study on optimization of extraction condition of tea polysaccharide from tea residue

JIAO Zi-ming1，GAO Ran2，YANG Jian-xiong1，3，*，GUO Qi1，DAI Jing-jing4，CHEN Bei3，MA Zhao-rui3
（1.College of Physics and Information Technology，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2.College of Journalism and Communication，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；3.College of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；4.College of Food Engineering and Nutrition Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

TS272

B

1002-0306（2012）16-0285-04

2012－01－10 *通訊聯(lián)系人

焦自明（1984-），男，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物的分離鑒定及功能評(píng)價(jià)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（10874108）。