趙世光，錢森和，張 焱，蔡為榮，王 陶

（1．安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖 241000；2．徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇徐州 221008）

響應面法優(yōu)化Ganoderma lucidum產(chǎn)漆酶種子培養(yǎng)基

趙世光1，錢森和1，張 焱1，蔡為榮1，王 陶2

（1．安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖 241000；2．徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇徐州 221008）

以菌絲體生物量為指標，采用響應面法對產(chǎn)漆酶的靈芝菌UIM281的種子培養(yǎng)基組成進行了研究。首先采用單因素實驗確定影響UIM281菌絲體生長的碳源、氮源及無機鹽的種類和濃度范圍。在此基礎上，應用Box-Behnken設計對影響菌絲體生物量的顯著因素進行優(yōu)化，最終建立了以菌絲體生物量為響應值的二次回歸方程模型，獲得了最適的菌絲體增殖種子培養(yǎng)基。結果表明，在VB10.1g/L的條件下最佳種子培養(yǎng)基組成為：玉米粉18.0g/L，豆餅粉12.3g/L，MgSO4·7H2O 1.8g/L，在28℃，150r/min條件下振蕩培養(yǎng)6d后，可獲得24.18g/L菌絲體，可為漆酶發(fā)酵培養(yǎng)提供質優(yōu)量大的接種體。

靈芝菌，漆酶，種子培養(yǎng)基，優(yōu)化，響應面法

Abstract：Targeting on mycelial biomass，response surface methodology（RSM） was applied to study the seeding medium components of UIM281，a Ganoderma lucidum strain producing laccase.Firstly，the categories and concentration scales of carbon source，nitrogen sources and inorganic salt affecting the growth of UIM281 mycelium were confirmed by single factor experiments.Based on this result，Box-Behnken design was used to optimize significant factors affecting mycelial biomass.Finally，the second-order equation model for mycelial biomass of UIM281 was established and seeding medium suitable to mycelial proliferation was obtained.The results showed when VB1was prior designated 0.1g/L，the optimal composing for seeding medium was as following：18.0g/L of corn flour，12.3g/L of soybean powder，1.8g/L of MgSO4·7H2O.When cultivated at 28℃and 150r/min for 6d，24.18g/L of biomass was obtained，which provided the excellent inoculum for the laccase fermentation.

Key words：Ganoderma lucidum；laccase；seed medium；optimization；response surface methodology

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在食品加工、造紙、廢水處理等方面具有廣泛的應用價值。靈芝菌（Ganoderma lucidum）除富含多糖、三萜類和肽類等有效生物活性成分外，也是產(chǎn)漆酶的重要真菌。在真菌漆酶發(fā)酵領域，高產(chǎn)菌株的選育、發(fā)酵工藝及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化已開展了很多研究[1-2]。漆酶發(fā)酵培養(yǎng)主要采用兩種接種方式：一是采用從斜面或平板上挑取菌片直接接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行漆酶發(fā)酵[3-4]，二是采用經(jīng)種子擴培后再接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行產(chǎn)酶[5-6]；兩類研究的重點多集中在發(fā)酵培養(yǎng)基及誘導產(chǎn)酶培養(yǎng)工藝的優(yōu)化[7-8]。而真菌漆酶是在生產(chǎn)菌株菌絲體生長良好后被誘導分泌的次級代謝產(chǎn)物，在規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)中，第一種接種方式會延長菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的適應時間，造成部分營養(yǎng)物質被菌絲體生長而消耗，導致產(chǎn)酶時間推遲，發(fā)酵周期延長。而將斜面菌株經(jīng)種子培養(yǎng)基增殖擴培后再接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，則可實現(xiàn)生產(chǎn)菌株生長期和生產(chǎn)期的分離，可有效避免這種缺陷。響應面法（RSM）能夠在有限的次數(shù)內，對影響生物過程的關鍵因子及其交互作用進行優(yōu)化、評價，以獲得影響過程的最佳條件，已成功應用于種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化[9-10]。本研究室利用離子注入手段選育出一株漆酶高產(chǎn)靈芝菌突變株UIM281，本文對影響UIM281菌絲體生長、增殖的碳源、氮源、無機鹽種類及其濃度范圍進行考察，采用響應面法對其營養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期獲得能夠擴培出菌球均一、菌絲體生物量大的液體種子培養(yǎng)基，為進一步漆酶發(fā)酵提供質優(yōu)量大的接種體，為漆酶工業(yè)化發(fā)酵提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 靈芝菌UIM281由本實驗室選育，4℃條件下保存于PDA斜面；斜面培養(yǎng)基（g/L） 馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂18，pH7.0；液體基礎培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖20，蛋白胨10，KH2PO41，VB10.1，pH 6.0。

SHB-III循環(huán)水真空泵；TU-1800紫外-可見分光光度計；HZQ-F160恒溫搖床；ZK-82A型電熱真空干燥箱；TGLL-18K臺式高速冷凍離心機；LDZX-40高壓滅菌鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子搖瓶培養(yǎng) 從靈芝菌斜面切取黃豆粒大小菌塊點種于PDA平板中心，28℃培養(yǎng)5～7d，至菌絲體長滿2/3平板，挑選生長良好的平板，用打孔器切取直徑1cm菌塊3塊，接入已裝有50mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于28℃，150r/min的條件下按照種子培養(yǎng)基優(yōu)化設計方案進行6d振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 生物量測定[11]種子培養(yǎng)結束后，經(jīng)兩層紗布過濾，再經(jīng)真空泵抽濾獲得菌絲體，60℃恒溫烘至恒重，電子天平稱重，測得菌絲體生物量。

1.2.3 種子培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗 分別以不同濃度的碳源、氮源、無機鹽代替基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4，按照種子搖瓶培養(yǎng)條件進行6d振蕩培養(yǎng)后，測定菌絲體生物量，考察單因素對種子生長的影響，并確定相應的濃度范圍。

1.2.3.2 Box-Behnken設計 根據(jù)單因素實驗結果確定最佳碳源、氮源、無機鹽及其相應濃度范圍后，以玉米粉（X1）、豆餅粉（X2）和MgSO4·7H2O（X3）三個因素為自變量，以菌絲體生物量（Y）為響應值，設計三因素三水平的Box-Behnken實驗。實驗設計因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結果與討論

2.1 不同營養(yǎng)條件對靈芝菌種子培養(yǎng)生物量的影響

2.1.1 碳源對生物量的影響 從圖1可以看出，除茶餅粉外，其他碳源對UIM281菌絲體生長均有一定的促進作用，以多糖類碳源的促進作用最為明顯。以玉米粉為碳源，當其濃度為25g/L時生物量最高，繼續(xù)提高其濃度不會對菌絲體生長產(chǎn)生顯著效果（圖2）。玉米粉作為一種遲效碳源，在菌絲體生長過程中可被逐漸分解、利用，其蛋白質、維生素和礦物質等營養(yǎng)成分全面，可作為種子增殖培養(yǎng)的適宜碳源。茶餅粉中雖然含有35%～40%的多糖，但其內含的皂素、多酚等物質對微生物的生長不利，這可能抑制了菌絲體增殖，不適合作為UIM281碳源使用。

圖1 不同碳源對生物量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the biomass

圖2 玉米粉濃度對生物量的影響Fig.2 Effect of corn flour concentration on the biomass

2.1.2 氮源對生物量的影響 從圖3可以看出，UIM281對有機氮源的利用效果明顯優(yōu)于無機氮源，以豆餅粉效果最佳，蛋白胨、酵母膏次之。低濃度豆餅粉對菌絲體生長促進作用明顯，當其濃度高于15g/L后，生物量基本保持恒定（圖4）。同時觀察到，培養(yǎng)基中過高濃度的豆餅粉可導致培養(yǎng)液粘稠，抑制了規(guī)則狀菌球的形成，出現(xiàn)大團狀結塊，不利于溶氧。豆餅粉中的氨基酸種類和含量較豐富，且價格低廉，以其作為適宜的氮源，其濃度不宜超過20g/L。

圖3 不同氮源對生物量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the biomass

圖4 豆餅粉濃度對生物量的影響Fig.4 Effect of soybean power concentration on the biomass

2.1.3 無機鹽對生物量的影響 圖5表明，與K+相比，Mg2+有利于UIM281菌絲體的生長，而Cu2+、Fe2+、Mn2+則抑制菌絲體增殖。Mg2+與生物量呈現(xiàn)一定程度的濃度依賴性，低濃度時對菌絲體生長有促進作用，高濃度則明顯抑制菌絲體生長，當濃度為1.5g/L時，可獲得最高生物量。所以，在后續(xù)實驗設計中，選擇Mg2+做優(yōu)化實驗。

圖5 不同無機鹽對生物量的影響Fig.5 Effect of different inorganic salt on the biomass

圖6 鎂離子濃度對生物量的影響Fig.6 Effect of Mg2+concentration on the biomass

2.2 響應面設計優(yōu)化種子培養(yǎng)基

根據(jù)單因素實驗結果，確定玉米粉、豆餅粉和MgSO4·7H2O作為影響U281生物量的關鍵因素，以生物量為指標，設計響應面實驗，實驗設計及結果見表2。

表2 響應面設計及結果Table 2 Design and results for RSM

運用SAS軟件對實驗結果進行回歸擬和，獲得生物量對培養(yǎng)基中的玉米粉、豆餅粉和MgSO4濃度的多元二次回歸方程。

Y=24.84-1.54125X1-6.48125X2-1.0775X3-4.88375X12+4.3475X1X2-8.84875X22-0.385X2X3-5.47125X32-7.395X1X3

二次模型方差分析（表3）表明，回歸模型Pr＞F=0.000564，失擬項Pr＞F=0.166038，表明模型回歸極顯著，失擬不顯著；該模型的一次項、二次項對生物量的影響均達到極顯著水平，交互項對生物量影響也顯著?；貧w方程多元相關系數(shù)為0.9842，表明98.42%的實驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋，模型與實際情況擬合得很好，可以用此方程代替真實實驗點進行分析和預測。通常情況下變化系數(shù)（CV）越低，實驗的精確度和可信度越高，CV值等于12.82%，表明Box-Behnken實驗的可信度和精確度較好；精密度是有效信號與噪聲的比值，大于4.0視為合理，本實驗精密度達到15.047。

表3 二階回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for quadratic regression eqution

二次模型中回歸系數(shù)顯著性檢驗（表4）表明，X2對生物量的線性效應極顯著，而X1和X3不顯著；X12、X22、X32對生物量的曲面效應均達到極顯著；X1和X2，X1和X3對生物量的交互影響極顯著。以上分析表明實驗因素對響應值的影響不是單純的線性關系，彼此存在交互作用。

表4 二階回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Regression coefficients and their significances tests for quadratic eqution

2.3 菌絲體生物量的響應面分析

將X1、X2、X3三個參數(shù)分別固定，Y指標隨其余的兩個參數(shù)變化趨勢分別如圖7～圖9所示。

圖7Y=f（X1，X2）的響應面分析Fig.7RSM analysis for Y=f（X1，X2）

圖7表明，在選定的實驗水平范圍內，生物量指標較高值落在X1、X2較低水平范圍，表明豆餅粉與玉米粉濃度較低時可獲得較高的生物量；繼續(xù)提高二者濃度則不利于菌絲體生長，生物量均呈現(xiàn)逐步減少的趨勢。在等高線圖中，沿X2軸向等高線變化密集，而X1軸向等高線的變化相對稀疏，故豆餅粉對生物量峰值的影響大于玉米粉，是影響生物量的主要效應因子。

圖8Y=f（X1，X3）的響應面分析Fig.8RSM analysis for Y=f（X1，X3）

圖8顯示了豆餅粉處于中心水平時，玉米粉與MgSO4·7H2O對生物量的交互影響。從等高線圖可以看出X1、X3二因素間的交互作用較顯著，因為等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，橢圓形等高線表示二因素交互作用顯著[12]。生物量隨MgSO4·7H2O與玉米粉濃度的增加都呈現(xiàn)逐步增加的趨勢；到達最高極值點后生物量不再顯著增加，這表明繼續(xù)增大培養(yǎng)基中玉米粉和MgSO4·7H2O的濃度，不會對菌絲體的生長產(chǎn)生顯著的促進效果。

圖9Y=f（X2，X3）的響應面分析Fig.9RSM analysis for Y=f（X2，X3）

圖9表明，隨著豆餅粉濃度的增加，生物量呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢；而MgSO4·7H2O濃度的增加對生物量不構成顯著影響，其對應的生物量只在小幅范圍變化。從圖中等高線與坐標軸的交點數(shù)可見，豆餅粉對生物量的影響遠大于MgSO4·7H2O，是主要的影響因素。

由以上分析可知，豆餅粉對生物量有極顯著影響，這與方差分析（表4）的結果一致。對回歸方程中X1、X2和X3求一階偏導并使其等于零，得到響應面穩(wěn)定極值點對應的培養(yǎng)基參數(shù)：X1=-0.69815，X2=-0.54627，X3=0.39256，即玉米粉18g/L，豆餅粉12.3g/L，MgSO4·7H2O 1.8g/L，此時理論生物量達到26.94g/L。采用上述最優(yōu)條件配制種子培養(yǎng)基，實際獲得3組平行實驗生物量的平均值為24.18g/L，與理論預測值相差不大，說明該模型對響應值的預測性很好。

3 結論

首先采用單因素實驗確定了適合UIM281菌絲體生長的廉價適宜的碳源、氮源及無機鹽，分別為玉米粉、豆餅粉和MgSO4·7H2O，并分別確定了各自的適宜濃度范圍。在此基礎上采用響應面法建立了以菌絲體生物量為響應值的全變量二次回歸模型，在VB10.1g/L的條件下，得到了UIM281種子培養(yǎng)的優(yōu)化條件：玉米粉18g/L，豆餅粉12.3g/L，MgSO4·7H2O 1.8g/L，在28℃，150r/min條件下振蕩培養(yǎng)6d后，獲得24.18g/L菌絲體，且菌絲體呈較規(guī)則球狀，大小較均一，為下一步的產(chǎn)漆酶發(fā)酵提供優(yōu)良的接種體奠定了良好基礎。

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Optimization of the seed medium for laccase-producing strain Ganoderma lucidum by response surface methodology

ZHAO Shi-guang1，QIAN Sen-he1，ZHANG Yan1，CAI Wei-rong1，WANG Tao2
（1.Biochemical Engineering College of Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2.Food and Bio-engineering Department of Xuzhou Engineering College，Xuzhou 221008，China）

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）16-0232-05

2011－12－12

趙世光（1977-），男，博士，副教授，研究方向：微生物酶工程、農產(chǎn)品加工副產(chǎn)物高值化利用。

安徽省高校省級自然科學研究項目（KJ2011B025）；安徽工程大學引進人才科研啟動基金（2007YQQ007）；安徽省科技廳國際科技合作計劃項目（10080703035）。