呂二盼，周 正，周 巍，李洋洋，張 薇，吳 濤，曾小盼，李 波，張 偉，*

（1.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，河北石家莊 050091；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

動物源性食品鴨血、豬血DNA提取及多重PCR鑒別研究

呂二盼1，2，周 正1，周 巍1，李洋洋2，張 薇1，吳 濤1，曾小盼1，李 波1，張 偉2，*

（1.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，河北石家莊 050091；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

目的：研究從鴨血、豬血中提取DNA的快速簡便方法并建立多重PCR鑒別方法。方法：用KI提取法從固體塊狀鴨血、豬血中提取DNA，經(jīng)PCR擴增檢測提取效果。建立多重PCR方法鑒別動物源性食品中的鴨血、豬血成分，并對市售動物源性血制品進行檢測。結(jié)果：這種方法提取到的DNA純度較高，凝膠電泳條帶整齊，背景清晰；PCR反應(yīng)能擴增出目的條帶。多重PCR能同時擴增出鴨和豬的條帶。結(jié)論：這種改進的DNA抽提方法能獲得高純度DNA，比傳統(tǒng)方法安全、簡便、節(jié)省試劑，PCR擴增結(jié)果很好，應(yīng)用多重PCR方法能同時檢測出血樣制品中的鴨、豬成分。

鴨血、豬血DNA，核酸提取，多重PCR檢測

Abstract：Objective：Study on duck blood and pig blood aimed to find a quick and easy way to extract DNA and establish multiple PCR method for identification.Methods：The KI method was used for DNA extracting from the solid massive duck blood and pig blood and was detected by PCR amplification.A multiplex PCR method was established to identify the duck，pig blood ingredients in the food of animal original and carried on the examination to animal blood products from the market.Results：The gel electrophoresis stripes indicated that this DNA extraction method was of high purity，clear and neat.And the target bands could be amplified by PCR.Multiplex PCR simultaneously amplified duck and pig bands.Conclusion：The improved DNA extraction methods could obtain the DNA of high purity.It was safe，convenient and economical compared with the traditional method.PCR.Amplification result was good，the application of multiplex PCR method could also detect duck and pig ingredients in the blood product sample.

Key words：duck，pig blood DNA；nucleic acid extracting；multiplex PCR detect

近年來，隨著瘋牛病、羊瘙癢病、口蹄疫、禽流感等一些疾病在歐洲及世界各國的流行，以及一些動物源食品摻假造假現(xiàn)象的普遍產(chǎn)生，對食品、藥品以及飼料產(chǎn)品進行動物源性成分鑒定，已經(jīng)成為一個備受關(guān)注的問題[1-2]。尤其是現(xiàn)在時期，動物源性食品摻假、過分添加各種添加劑、使用非食用性原料和成分等各種食品安全問題不斷出現(xiàn)，去年雙匯瘦肉精事件、染色饅頭事件、河南南陽毒韭菜事件等食品安全事件的頻發(fā)越來越讓老百姓心驚膽顫。近年來有不少關(guān)于動物全基因組DNA提取的研究和報道[3-4]，但以血樣做材料的研究比較少，同時由于不同的材料和提取方法的差異，提取的基因組DNA的純度和量也有所不同，如何選取合適的組織材料利用恰當?shù)姆椒▉硖崛「哔|(zhì)量的基因組DNA，是一個值得探討的問題[5]。鴨血因營養(yǎng)價值高、食用功效好而價格明顯高于豬血價格，部分商家為了盈利可能會在鴨血中摻雜豬血甚至牛血、雞血來銷售。針對鴨血的加工過程及現(xiàn)實中存在的上述問題，本研究針對如何從鴨血、豬血中提取高質(zhì)量DNA進行分析比較，對傳統(tǒng)的方法進行了改進[6]，在省時、高效的同時減少對操作人員的身體危害。以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)被廣泛用來鑒定食品中的動物源性成分[7-8]，高質(zhì)量、高純度及結(jié)構(gòu)完整的基因組DNA的獲得是開展該方面研究工作的前提，是保證各檢驗檢疫機構(gòu)順利進行這項工作的必要條件。本實驗分別采用鴨、豬特異性引物對從血樣中提取的DNA進行PCR檢測。在此基礎(chǔ)上進一步研究在同一體系中加入豬和鴨的引物以及幾種動物血樣的混合模板建立多重PCR快速鑒別方法，之后隨機抽取一定數(shù)量的市售血樣制品（主要是血豆腐食品）進行實際樣品的檢測，來驗證該方法的準確性和可操作性，為各監(jiān)管部門和檢疫機構(gòu)提供實際指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鴨血、豬血 石家莊超市；氯仿、異戊醇、無水乙醇 優(yōu)級純；醋酸鈉 分析純，純度99%，配制成3mol/L；KI分析純，純度98.5%，配制成6mol/L，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；引物 生工生物工程（上海）有限公司合成；PCR體系預(yù)混液Premix Taq Version 2.0（Loading dye mix） 寶生物工程（大連）有限公司，溶液組成：Taq酶1.25U/μL；dNTP Mixture 2×conc各0.4mmol/L；Taq Buffer 2×conc 3mmol/L Mg2+，色素Marker，比重增加物，穩(wěn)定劑。

DYY-4C型電泳儀 配有DYCP-31系列DNA水平電泳槽和垂直電泳槽，北京市六一儀器廠；Universal Hood II凝膠成像儀 配有WHITE和UV燈，Quantity One圖像分析處理系統(tǒng)，美國BIORAD公司；Mastercycler gradient PCR儀 配有96孔反應(yīng)板和可調(diào)梯度設(shè)置，德國Eppendorf；TGL-16B臺式高速離心機 配有12孔可調(diào)離心轉(zhuǎn)子，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 引物

參照文獻[9]合成擴增鴨源性成分的引物，參照文獻[10]合成擴增豬源性成分的引物，引物序列及擴增片段長度見表1。

表1 引物序列及擴增片段長度Table 1 The primer sequence and amplification length

1.3 實驗方法

1.3.1 KI法提取DNA 取0.4g血樣于1.5mL EP管中，在液氮環(huán)境中搗碎；加雙蒸水400μL溶解，搖勻20s；混勻后加6mol/L KI溶液400μL，搖勻20s，12000r/min離心12min；取上清，加等體積氯仿/異戊醇（24∶1），即加即搖，混勻，12000r/min離心10min；取上清，加1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫沉淀15min，12000r/min離心10min；小心倒掉上清，吸水紙上拍干，用-20℃保存的75%乙醇洗滌（500μL或1mL），不振動，12000r/min離心10min；棄乙醇，干燥后，加TE溶液30μL溶解DNA[11]，制成的DNA溶液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA質(zhì)量及純度檢測 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取鴨血、豬血基因組總DNA片斷大小及DNA的降解情況，以檢測其完整性和質(zhì)量。電泳完后凝膠成像分析。

提取的溶于TE的DNA樣品經(jīng)稀釋后，以TE做空白對照在紫外分光光度計上測260nm和280nm的光吸收，根據(jù)OD260nm/OD280nm來估計DNA的純度。根據(jù)公式計算DNA濃度或儀器計量顯示濃度。

DNA濃度（μg/μL）=OD260nm×核酸稀釋倍數(shù)×50/1000

1.3.3 引物特異性檢測 利用鴨的引物，分別以鴨、雞、牛、羊、豬的DNA為模板進行PCR擴增；用豬的引物，分別以鴨、雞、牛、羊、豬的DNA為模板進行PCR擴增，以鑒定引物的特異性。

1.3.4 建立多重PCR方法鑒別摻假成分 雙重PCR反應(yīng)體系為：預(yù)混液25μL，鴨引物各2μL，豬引物各0.5μL（引物濃度為20μmol/L），鴨模板1μg，豬模板0.5μg，用ddH2O補足體系50μL。雙重PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火40s，72℃延伸60s，35個循環(huán)；72℃延伸7min。

之后將雞血、兔血與鴨血、豬血以適當比例混合均勻后，提取幾種動物的總DNA，然后用鴨、豬特異性引物進行多重PCR反應(yīng)。多重PCR反應(yīng)體系為：預(yù)混液25μL，鴨引物各2μL，豬引物各0.5μL（引物濃度為20μmol/L），混合模板2μg，用ddH2O補足體系50μL。多重PCR反應(yīng)條件同雙重PCR反應(yīng)。檢測結(jié)果通過2%的瓊脂糖凝膠電泳確定。

1.3.5 多重PCR靈敏度檢測 將雞血、兔血、鴨血、豬血等比例混合后用1.3.1方法提取總基因組DNA，模板DNA經(jīng)10、100、200、1000、2000倍系列稀釋后進行PCR擴增，以檢測多重PCR方法的靈敏度[12]。

1.3.6 實際樣品檢測 在建立多重PCR的快速鑒別方法后，我們將研究對象擴展到實際樣品，以檢測用多重PCR方法能否成功擴增出市售血制品中所含的動物源性成分，來進一步驗證方法的準確性和可行性。我們從超市和集貿(mào)市場上隨機購買13種常見的血豆腐制品，用多重PCR方法進行了鴨源性成分和豬源性成分的檢測，同時用新鮮鴨血、豬血DNA做陽性對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取的DNA質(zhì)量及純度結(jié)果

常用的電泳緩沖液有TAE和TBE，TAE緩沖能力較低，后者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。此實驗所用緩沖體系為TBE電泳液，在室溫以5V/cm恒壓電泳，所提取的鴨血、豬血DNA電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知，此方法所獲基因組DNA均呈現(xiàn)亮帶，電泳條帶清晰、片段的大小一致，整齊均勻，背景清晰。所提DNA所測OD260nm/OD280nm值在1.70～1.93，濃度為（0.1～2.0）μg/μL。分光光度分析DNA的OD260nm/OD280nm數(shù)據(jù)與提取過程中有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的次數(shù)有關(guān)，反復(fù)沉淀的次數(shù)多了，DNA產(chǎn)品損失就大；沉淀的次數(shù)少了，蛋白質(zhì)分離就不徹底。紫外分光光度計是采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置產(chǎn)生特定波長的光，光源透過測試樣品時，分子中的某些基團吸收了紫外可見光，發(fā)生了電子能級躍遷而產(chǎn)生吸收光譜，反映了分子中基團的信息。吸收紫外光的性質(zhì)是嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質(zhì)，都有吸收紫外光的特性。堿基展開程度越大，紫外吸收就越厲害。通過紫外測得溶液的吸光度，計算樣品的吸光度值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度，二者成正比。核酸的λm＝260nm，即在波長260nm處有最高吸收峰。DNA是脫氧核糖核苷酸的高聚物，雙螺旋結(jié)構(gòu)。RNA是核糖核苷酸聚合而形成的沒有分支的單鏈，分子量比DNA??；DNA為線狀分子，RNA為線團。但紫外分光光度法不能區(qū)分DNA和RNA，OD260nm/OD280nm只能用來鑒定核酸的純度。純DNA的OD260nm/OD280nm比值為1.8，純RNA為2.0。由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的芳香氨基酸（酪氨酸和色氨酸），因此也能吸收紫外光。其吸收高峰在280nm波長處，可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)，在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，比值可進行核酸樣品純度評估。當OD260nm/OD280nm大于等于2.0，說明殘存的RNA較多；當OD260nm/OD280nm小于1.8，說明提的DNA不純，存在蛋白質(zhì)（芳香族）或酚等雜質(zhì)；當OD260nm/OD280nm等于1.8時，說明樣品中蛋白質(zhì)含量低，DNA純度高。由測得結(jié)果可知，提取的DNA無RNA和蛋白質(zhì)或酚的污染，且沒有在提取過程中發(fā)生降解。從血樣中提取的總DNA無論是濃度還是純度都較高，完整性很好，達到了PCR反應(yīng)的要求，能滿足分子生物學(xué)實驗的需要。

圖1 DNA提取結(jié)果Fig.1 The DNA extraction results of blood

2.2 引物特異性結(jié)果

利用鴨的引物，分別以鴨、雞、牛、羊、豬的DNA為模板進行PCR擴增；用豬的引物，分別以鴨、雞、牛、羊、豬的DNA為模板進行PCR擴增，特異性結(jié)果見圖2～圖3。圖2只有鴨血DNA的模板能擴增出226bp目的條帶；圖3只有豬血DNA的模板能擴增出149bp目的條帶，其他模板都是陰性。

圖2 鴨引物的特異性結(jié)果Fig.2 The specificity result of duck primer

圖3 豬引物的特異性結(jié)果Fig.3 The specificity result of pig primer

2.3 鴨血摻假多重PCR結(jié)果

經(jīng)過多次實驗對比優(yōu)化引物和模板濃度，得出上述1.3.4的加入量擴增效果最好，原因是引物之間存在競爭，豬引物的特異性較鴨引物更強。在一個體系中同時加入鴨和豬的引物，加入兩種血樣提取的混合模板，可同時擴增出鴨源性成分和豬源性成分，兩個目的條帶清晰，位置與陽性對照條帶也一致，由此我們成功建立了鴨血中摻雜豬成分的鑒別方法，此方法快速、簡便，一次反應(yīng)即可同時鑒別兩種動物源性成分，可為各檢驗機構(gòu)提供方法指導(dǎo)。雙重PCR結(jié)果見圖4。

圖4 雙重PCR結(jié)果Fig.4 Double PCR results

將雞血、兔血分別與鴨血、豬血等比例混合均勻后，用提取的總DNA進行多重PCR反應(yīng)，同時做陽性對照。由圖5結(jié)果可見，只能擴增出鴨和豬的特異性條帶，沒有雞和兔的非目的條帶，由此可以檢測未知的血樣中是否含有鴨和豬的成分。

圖5 多重PCR結(jié)果Fig.5 Multiple PCR results

2.4 多重PCR靈敏度結(jié)果

用KI法提取雞血、兔血、鴨血、豬血混合樣品的DNA，在一個反應(yīng)體系中同時加入鴨和豬的引物，加入四種動物血不同稀釋度的混合模板，經(jīng)PCR擴增后電泳顯示，隨著模板濃度的降低，兩個目的條帶的亮度逐漸減弱，如圖6所示，當稀釋1000倍時，條帶仍很明顯；當稀釋2000倍時，豬的條帶很暗，但仍可看出，鴨的成分未擴增出來，即稀釋至原DNA提取液的0.05%時，才不能檢測出鴨成分，此方法的檢測靈敏度為0.1%。多重PCR對豬血的靈敏度較鴨血更高，與實驗中單一PCR靈敏度結(jié)果相符合，可能是引物的原因。

圖6 多重PCR靈敏度結(jié)果Fig.6 Sensitivity results of multiple PCR

2.5 實際樣品檢測結(jié)果

隨機抽取的13個樣品中，10個都檢測出鴨源性成分，但有的也摻雜有豬血，3個樣品鴨成分為陰性，有的是豬血做的假冒產(chǎn)品，有的可能是豬血外的其他動物血制成。3個樣品同時檢測出鴨和豬兩種成分。結(jié)果見表2。證明此方法能檢測血豆腐制品中的鴨源性成分和豬源性成分能進行假冒偽劣產(chǎn)品的鑒別，可進行推廣應(yīng)用。

表2 實際樣品檢測結(jié)果Table 2 Results of Actual samples

3 結(jié)論

基因組DNA的提取過程，研究中對經(jīng)典酚-氯仿抽提法進行了改進。對于樣品的預(yù)處理，采用液氮進行冷凍研磨，防止了因研磨過程中發(fā)熱而導(dǎo)致的DNA降解和斷裂，從而保證了DNA的完整性，且節(jié)省時間。KI在高溫不穩(wěn)定，而在此實驗中沒有水浴加熱過程，都是在室溫操作（條件允許可用可調(diào)溫度離心機4℃離心），且使用的是雙蒸水，不用擔(dān)心水中含有Cl-等而導(dǎo)致的碘被氧化問題。DNA沉淀加NaAc等鹽可中和核酸負電荷，在酸性環(huán)境中促進核酸疏水復(fù)性，加無水乙醇可以使DNA沉淀完全，添加的量必須注意，NaAc控制在所吸取上清的1/12～1/10，無水乙醇要加2～3倍體積。本法不用水浴，所用試劑少，離心次數(shù)少，簡便、快速，不需特殊設(shè)備；所獲得的DNA無RNA、蛋白質(zhì)等污染；減少了各種有害因素對DNA的破壞，具有完整性好、純度高和穩(wěn)定性好等特點；可以滿足PCR、RFLP酶切、分子雜交等各種分子生物學(xué)實驗的需要。綜上所述，是切實可行的方法，對大量固體塊狀血樣制品的提取更為實用。

鑒別食品中的動物源性成分及各種食品的摻雜摻假，一直是各檢驗機構(gòu)工作的重點，用分子生物學(xué)的檢測方法比其他方法更準確、快速。本研究用PCR方法檢測血豆腐類制品準確率高，耗時短，從DNA提取到擴增所需檢測的動物成分，再電泳出結(jié)果，整個操作過程最多僅需3h，而且可一次同時對幾十個樣品進行檢測。建立的多重PCR方法更能顯示此方法的優(yōu)點，可一次反應(yīng)同時鑒別兩種成分，在鑒定真?zhèn)蔚耐瑫r還能具體測出鴨血豆腐是否摻雜有豬血成分。有的偽劣鴨血制品是用豬血以外的其他動物血制成，可能是雞血或牛血、兔血等，下一步我們會繼續(xù)研究建立鴨、豬、雞、牛、兔等的多重PCR鑒別方法來徹底解決這一難題，能準確鑒別鴨血制品中的其他多種動物源性成分，可為質(zhì)檢部門推廣應(yīng)用，作為實驗室的常規(guī)檢測手段。

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DNA extraction and multiple PCR distinction research of animal food duck blood and pig blood

LV Er-pan1，2，ZHOU Zheng1，ZHOU Wei1，LI Yang-yang2，ZHANG Wei1，WU Tao1，ZENG Xiao-pan1，LI Bo1，ZHANG Wei2，*
（1.Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research of Hebei，Shijiazhuang 050091，China；2.College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China）

Q789

A

1002-0306（2012）16-0228-05

2012－02－07 *通訊聯(lián)系人

呂二盼（1986-），女，碩士，研究方向：食品中有害微生物檢測與控制。

河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局重點項目（100102）。