段學(xué)輝，胡明明，熊福星，吳 量，陳加利，王 娟

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330047）

稻草粉基混合菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶研究

段學(xué)輝，胡明明，熊福星，吳 量，陳加利，王 娟

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330047）

以稻草粉為主要原料，對白腐菌（White-rot fungi）NS75和黑曲霉（Aspergillus niger）NS83進行固態(tài)混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶進行研究?；旌暇虘B(tài)發(fā)酵與單菌固態(tài)發(fā)酵實驗結(jié)果比較表明，混合菌發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶總體酶活明顯高于單菌種發(fā)酵，其β-葡萄糖苷酶（β-G）酶活較白腐菌NS75單菌發(fā)酵提高了120.9%；葡聚糖內(nèi)切酶（CMC）酶活比黑曲霉NS83單菌發(fā)酵提高了140.8%。單因素實驗和正交實驗結(jié)果表明，當(dāng)?shù)静莘埯熎べ|(zhì)量比為9∶1，料水比為1∶2，白腐菌NS75與黑曲霉NS83的接種比例為1∶1（v∶v）時，培養(yǎng)第3d開始攪拌，每天攪拌一次，于30℃，培養(yǎng)5d，稻草粉基混合菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中CMC酶活達到16650U/g，β-G酶活為16108U/g、濾紙酶活（FPA）酶活為3164U/g。

混合菌發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵，CMC酶，β-G酶，稻草粉

Abstract：Straw powder was used as the raw material，the solid fermentation conditions of cellulases production by mixed strains of White-rot fungi NS75 and Aspergillus niger NS83 had been investigated.The results of comparative experiments between single strain solid-state fermentation and mixed strains solid-state fermentation showed that，the cellulose enzyme activity produced by mixed strains had increased obviously than that produced in single strain solid-state fermentation，in which，the β-G enzyme activity had increased 120.9%than that produced by White-rot fungi NS75 single fermentation，and the CMC enzyme activity had increased 140.8%than that produce by Aspergillus niger NS83 single fermentation.According to the single factor and orthogonal experiment results the optimum fermentation conditions were determined as follows：ratio between straw powder and bran powder 9∶1，feed-water ratio 1∶2，inoculation volume ratio of White-rot fungi NS75 and Aspergillus niger NS83 1∶1（v∶v），start stirring on the third day and once a day，30℃ culture 5d.Under this conditions，the enzyme activity of CMC enzyme，β-G enzyme，F(xiàn)PA enzyme produced had reached respectively 16650，16108 and 3164U/g.

Key words：mixed strains fermentation；solid state fermentation；CMC enzyme；β-G enzyme；straw powder

稻草秸稈等生物質(zhì)是被丟棄量最大的有機原料。植物細胞壁的主要成分是纖維素，其占植物秸稈干重的33%～50%。使用可再生木質(zhì)纖維素資源生產(chǎn)乙醇能增加資源的利用率，降低環(huán)境污染，減少二氧化碳排放[1-3]。使用纖維素酶水解木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化成乙醇技術(shù)的關(guān)鍵點在于纖維素酶的生產(chǎn)成本和催化活性。一般生產(chǎn)用纖維素酶是一個復(fù)合酶系，它包括：纖維二糖水解酶（cellobiohydrolases，CBH）（1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶，EC 31211191）；葡聚糖內(nèi)切酶（endoglucanases，EG）（1，4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3121114）；β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases，β-G）或（β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，EC 31211121）[4-5]。不同生物質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其水解需要復(fù)合酶的共同作用[6-7]。目前采用單菌發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶存在酶系的不完整和個別酶活低的缺陷。如黑曲霉（Aspergillus niger）[8]發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶中內(nèi)切纖維素酶活性低。因此，多菌種混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶已逐漸引起研究者關(guān)注[9]。本研究使用實驗室保存的兩株纖維素酶產(chǎn)生菌—白腐菌（Whiterot fungi）NS75和黑曲霉（Aspergillus niger）NS83，在稻草粉為主要培養(yǎng)基上固態(tài)混合菌發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，考察了混合發(fā)酵的培養(yǎng)條件、纖維素酶產(chǎn)量和主要酶種活力。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

白腐菌（White-rot fungi）NS75、黑曲霉（Aspergillus niger）NS83 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室分離保藏；稻草 取于南昌農(nóng)田，粉碎過30目，高壓滅菌鍋高溫處理2h，烘干保存待用；硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、無水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；羧甲基纖維素鈉、水楊苷、3，5-二硝基水楊酸 化學(xué)純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；苯酚、七水合硫酸鎂、七水合亞硫酸鐵、一水合硫酸錳、六水合氯化鈷 分析純，廣東汕頭市西隴化工廠；檸檬酸、無水氯化鈣 分析純，上海試劑一廠。

MJPS-250型霉菌培養(yǎng)箱、DXB-501型超級恒溫水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KA-1000型低速離心機 上海安亭儀器廠；XSB-01型生物顯微鏡國營江西儀器總廠；AL104型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；756PC型紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；BHC-1300ⅡA/B3型生物安全柜 蘇靜集團安泰公司；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液及培養(yǎng)基的配制

1.2.1.1 3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液 稱取DNS 6.3g于500mL燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，加入2mol/L NaOH溶液262mL，再加到500mL、0.645mol/L酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5.0g結(jié)晶酚和5.0g無水亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后移入容量瓶中用蒸餾水定容至1000mL，充分混勻，貯于棕色瓶中，室溫放置1周后使用。

1.2.1.2 羧甲基纖維素溶液 稱取2.0g羧甲基纖維素鈉鹽置于200mL蒸餾水中，沸水浴中攪拌溶解，過濾，取濾液150mL，加檸檬酸緩沖液30mL以及蒸餾水60mL，混勻，貯存于冰箱中備用。

1.2.1.3 1%的水楊苷溶液 準(zhǔn)確稱取1.0g水楊苷，加入適量的pH為5.0的檸檬酸緩沖液溶解，再使用蒸餾水定容至100mL。

1.2.1.4 Mandels[10]營養(yǎng)液 （NH4）2SO41.4g/L，KH2PO42.0g/L，（H2N）2CO 0.3g/L，CaCl20.3g/L MgSO4·7H2O 0.3g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，CoCl2·6H2O 2.0mg/L。

1.2.1.5 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：Mandels營養(yǎng)液50mL加入1%的葡萄糖和0.5%硫酸銨。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基稻草8g，麩皮2g，營養(yǎng)液20mL。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 將在斜面上培養(yǎng)3～5d的白腐菌和黑曲霉菌，分別制成約107個/mL的孢子懸浮液。分別取1mL接于50mL液體種子培養(yǎng)基中，于30℃、150r/min培養(yǎng)24h，單菌發(fā)酵各菌分別接種2mL于250mL的廣口瓶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合菌發(fā)酵則保持接種總量2mL，白腐菌∶黑曲霉按2∶1比例接于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，30℃恒溫培養(yǎng)5～7d，單因素實驗每組3個平行。

1.2.3 粗酶液的制備 均勻地取1.0g物料加入10倍的檸檬酸緩沖液，攪拌均勻，在搖床上浸提1h，然后3500r/min，離心20min，取上清液，于4℃冰箱保存，備用。另取1.0g物料在45℃干燥至恒重，測得的酶活除以干重即為固態(tài)發(fā)酵底物的酶活，其單位為U·g-1干曲。

1.2.4 酶活力測定方法 CMC酶活和FPA酶活測定參考顏淑芳等文獻[11-12]。

β-G酶活測定參考蘇香萍等[13]的方法加以改進：取1mL的酶液加入到2mL、1%的水楊苷檸檬酸緩沖液中，50℃水浴保溫30min，DNS法測定還原糖含量。

酶活單位定義：上述反應(yīng)條件下，1min水解底物生成1μg葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位，換算成每克干物料含有的酶活，以U/g表示。

1.2.5 單菌與混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶對比實驗設(shè)計 分別將白腐菌孢子液、黑曲霉孢子液接入到裝有10g稻草粉麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基，容積為250mL的廣口瓶中。接種量均為2mL，混合菌發(fā)酵則白腐菌∶黑曲霉按2∶1比例接種。于培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)，發(fā)酵7d，分別測CMC酶、FPA酶和β-G酶活。

1.2.6 單因素實驗設(shè)計

1.2.6.1 稻草粉麩皮質(zhì)量比對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 實驗保持固態(tài)培養(yǎng)基中麩皮與稻草總量10g，稻草粉與麩皮質(zhì)量百分比為4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4，接種總量2mL，白腐菌∶黑曲霉按2∶1接種，發(fā)酵5d測酶活。

1.2.6.2 培養(yǎng)基料水比對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在固料為10g的基礎(chǔ)上，料水比按1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3的比例加入Mandels營養(yǎng)液，混合均勻，接種。30℃恒溫培養(yǎng)5d測酶活。

1.2.6.3 發(fā)酵過程中攪拌對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

實驗按以下5種方式進行。a：不攪拌；b：只第2d攪拌；c：從第2d開始攪拌，每天攪拌一次；d：從第3d開始攪拌，每天攪拌一次；e：第4d攪拌。攪拌方式為用無菌鐵勺在超凈臺上對培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基進行攪拌，每次攪拌2min。培養(yǎng)5d測酶活。

1.2.6.4 混合菌接種比對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 實驗保持接種總量2mL不變，白腐菌NS75∶黑曲霉NS83比例按3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3五個比例考查混合菌接種比例對產(chǎn)酶的影響。

1.2.7 正交實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對料水比、稻草粉含量、攪拌方式和混合菌接種比例進行4因素3水平正交設(shè)計實驗，分別測定CMC酶活、β-G酶活、FPA酶活，最終以CMC酶活為考察指標(biāo)優(yōu)化產(chǎn)酶條件，正交設(shè)計因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

2 結(jié)果與討論

2.1 單菌與混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶情況對比

單菌和混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶情況如圖1～圖3所示。

由圖1可知，白腐菌（White-rot fungi）NS75具有較高的產(chǎn)CMC酶能力，并且在培養(yǎng)第5d酶活達到高點10400U/g，但其產(chǎn)β-G酶能力較弱，酶活為5311U/g。從圖2可知，黑曲霉（Aspergillus niger）NS83產(chǎn)β-G酶能力較強，培養(yǎng)5d酶活達到10706U/g，但產(chǎn)CMC酶較弱，酶活只有4790U/g。白腐菌NS75與黑曲霉NS83混合發(fā)酵的圖3結(jié)果表明，其CMC酶活和β-G酶活都比較高，在培養(yǎng)第5d酶活分別達到11533、11730U/g。相較單菌發(fā)酵，混合發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶系全，酶活更高，其原因可能是混合發(fā)酵，兩株菌之間纖維素酶酶系互補，各組分酶的底物反饋抑制作用也相應(yīng)減弱，使得各菌處于有利的環(huán)境下生長代謝產(chǎn)酶。

圖1 白腐菌NS75的產(chǎn)酶曲線Fig.1 Curve of enzyme production from White-rot fungi NS75 fermentation

圖2 黑曲霉NS83的產(chǎn)酶曲線Fig.2 Curve of enzyme production from Aspergillus niger NS83 fermentation

圖3 白腐菌NS75與黑曲霉NS83混合發(fā)酵產(chǎn)酶曲線Fig.3 Curve of enzyme production from White-rot fungi NS75 and Aspergillus niger NS83 mixed fermentation

2.2 稻草粉用量對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由圖4可知，完全加稻草粉或完全加麩皮粉的產(chǎn)酶情況不如稻草粉與麩皮粉混合時產(chǎn)酶情況好，稻草粉和麩皮混合添加時，混合菌產(chǎn)酶能力較強。其原因與稻草粉和麩皮的成分有關(guān)，麩皮中含有淀粉酶、氧化酶、過氧化氫酶等、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等[14]，這些物質(zhì)都促進菌體的生長；稻草主要有果膠、木質(zhì)素、半纖維素、纖維素、灰分和粗蛋白等物質(zhì)[15]，菌體不能很好的利用這些物質(zhì)，但其中的纖維素卻能誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生纖維素酶。少量的麩皮有利于前期菌體生長，大量稻草誘導(dǎo)菌體中后期產(chǎn)酶，當(dāng)?shù)静菖c麩皮質(zhì)量比為3∶1時，混合菌產(chǎn)酶能力較高，CMC酶活達到135234U/g，β-G酶活達到13086U/g，F(xiàn)PA酶活達到2650U/g。

圖4 稻草與麩皮的質(zhì)量比對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of different ratio between rice straw and wheat bran on enzyme activity

2.3 培養(yǎng)基料水比對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

固態(tài)發(fā)酵中，培養(yǎng)基中的含水量是一個重要參數(shù)，本次實驗考查含水量對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。由圖5可知，當(dāng)料水比為1∶2時，混合菌產(chǎn)酶效果較好，說明混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，濕度會影響菌體的生長，孢子的形成以及酶的產(chǎn)生，水分過少或過多都不利。

圖5 培養(yǎng)基料水比對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of different feed-water ratio on enzyme activity

2.4 發(fā)酵過程中攪拌對混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

實驗對固態(tài)發(fā)酵中基質(zhì)的混勻，菌的分散對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響進行了考查。實驗結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，攪拌方式d和攪拌方式c發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶酶活較高；與攪拌方式a和b相比，c和d攪拌次數(shù)多，物料和菌體分散更均勻，培養(yǎng)基中氧的含量也隨攪拌增多，有利于混合菌的生長和產(chǎn)酶；攪拌方式e由于攪拌太晚，菌體可能已經(jīng)到了生長和產(chǎn)酶中后期，所以效果不明顯；攪拌方式c和d比較，方式d保證菌體具有足夠的時間適應(yīng)環(huán)境和前期生長繁殖，而方式c攪拌開始時菌體可能還未適應(yīng)環(huán)境，菌體生長和菌絲體形成受到攪拌影響菌，因此方式c培養(yǎng)不如方式d培養(yǎng)產(chǎn)酶效果好。

圖6 不同的攪拌方式對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of different stirring modes on enzyme activety

2.5 混合菌接種比對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

結(jié)果如圖7所示。從圖7中可以看出，白腐菌NS75主導(dǎo)CMC酶生產(chǎn)，黑曲霉NS83主要產(chǎn)β-G酶，隨著黑曲霉NS83接種比例的增加，混合菌發(fā)酵產(chǎn)β-G酶活明顯上升，但CMC酶酶活下降，綜合考慮白腐菌NS75∶黑曲霉NS83的接種比為1∶1時產(chǎn)酶的酶系組成較好。

圖7 混合菌接種比例對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of different White-rot fungi NS75 and Aspergillus niger NS83 ratio on enzyme activity

2.6 混合菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對料水比、稻草粉含量、攪拌方式和混合菌接種比例進行4因素3水平正交設(shè)計實驗，分別測定CMC酶活、β-G酶活、FPA酶活。鑒于CMC酶為纖維素酶系中的主要組分，且能夠有效地表達發(fā)酵產(chǎn)酶效果，實驗選擇以CMC酶活為考察指標(biāo)進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，正交設(shè)計見表1，正交實驗及結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

從表2中9組實驗的CMC酶直觀分析結(jié)果可以看出，混合菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶最優(yōu)實驗組為第2組，即稻草粉麩皮質(zhì)量比為9∶1，料水比為1∶2，從培養(yǎng)第3d開始攪拌，每天攪拌1次，菌種比為1∶1，與極差分析得到的優(yōu)化組合A1B2C2D2相一致，這個組合下CMC酶活達到16650U/g。各培養(yǎng)條件對混合菌產(chǎn)酶的影響順序為：攪拌方式＞料水比＞稻草含量＞菌種比。由表3可以看出，攪拌方式（C）對混合菌產(chǎn)酶的影響顯著，這可能是因為攪拌使得固態(tài)培養(yǎng)基中的含氧量增大，菌體、水分的分散更加均勻，因此在固態(tài)發(fā)酵過程中應(yīng)該設(shè)法對培養(yǎng)基進行間隙攪拌。

表3 正交實驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

選擇稻草麩皮質(zhì)量比為9∶1，料水比為1∶2，從培養(yǎng)第3d開始攪拌，每天攪拌1次，接種比為1∶1固態(tài)混合發(fā)酵條件，對正交實驗結(jié)果進行驗證，三組平行實驗的CMC酶活分別為16685、16723和16628U/g，平均值為16679U/g，與正交實驗直觀分析所得最優(yōu)條件所得值16650U/g十分接近。

3 結(jié)論

單菌發(fā)酵和混合菌發(fā)酵實驗結(jié)果比較表明，采用雙菌種混合發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶酶系全且酶活更高，相比于白腐菌NS75單菌發(fā)酵產(chǎn)生的CMC酶活10400U/g、β-G酶活5311U/g和FPA酶活2123U/g，混合菌發(fā)酵產(chǎn)生的CMC酶活達到11533U/g，β-G酶活達到11730U/g，F(xiàn)PA酶活達到2483U/g，分別提高了約10.9%、120.9%和17.0%；相比于黑曲霉NS83單菌發(fā)酵產(chǎn)生的CMC酶活4790U/g、β-G酶活10706U/g和FPA酶活2221U/g，混合菌發(fā)酵CMC酶活提高了140.8%，β-G酶活提高了9.6%，F(xiàn)PA酶活提高了11.8%。

在優(yōu)化發(fā)酵條件：稻草與麩皮質(zhì)量比為9∶1，料水比（W發(fā)酵物料∶W營養(yǎng)鹽液）為1∶2，菌種白腐菌NS75與黑曲霉NS83的接種比例為1∶1（v∶v），從培養(yǎng)第3d開始攪拌，每天攪拌一次，培養(yǎng)5d，白腐菌NS75與黑曲霉NS83固態(tài)混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的CMC酶活達到16650U/g，β-G酶活為16108U/g、FPA酶活為3164U/g，比初始條件下混合發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活分別提高了44.4%、37.3%和27.4%。

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Cellulases produced by mixed strains fermentation in straw powder

DUAN Xue-hui，HU Ming-ming，XIONG Fu-xing，WU Liang，CHEN Jia-li，WANG Juan
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Life Science and Food Enginerring，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）16-0224-05

2012－01－12 *通訊聯(lián)系人

段學(xué)輝（1958-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)、綠色化工技術(shù)。