李 靜 張一娜 范 鷹 馬 蘭 姜禮紅 崔 璨 吳 博

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院老年病科，黑龍江 哈爾濱 150086)

由于帕金森病(PD)的復雜性目前尚未發(fā)現(xiàn)理想的治療方法，以阻止神經(jīng)元退行性變，修復已損傷的神經(jīng)元，臨床上只能針對癥狀進行對癥治療，因此對帕金森病發(fā)病機制的研究依然非常重要。MAPK家族重要成員細胞外信號調節(jié)激酶(ERK1/2)研究得最早最深入。它在細胞分化、發(fā)育、存活及死亡等生理過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。但ERK1/2在細胞凋亡性死亡時的變化及其意義卻存在爭議〔1〕。因此本研究擬在6-OHDA致PC12細胞損傷模型上，觀察ERK通路的表達，并引入特異性的抑制劑U0126和PD98059以探討ERK通路在帕金森病發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞，胎牛血清、DMEM(美國Invitrogen公司)，6-OHDA、MTT、U0126 和 PD98059(英國 Sigma-Aldrich 公司)，一抗總 ERK1/2(L34F12，鼠單克隆)，p-ERK1/2(Thr202/Tyr204，兔多克隆)(美國CST公司)，Odyssey IRDye 800 nm熒光抗兔二抗、Odyssey IRDye 700 nm熒光抗鼠二抗(美國Li-COR Biosciences公司)，Hoechst 33258染色試劑盒購自碧云天公司。其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) 復蘇凍存的PC12細胞，接種于含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，隔天換液并傳代。用0.05%的胰蛋白酶消化使細胞從瓶壁上分離下來，以1∶3～1∶4傳代，當細胞進入對數(shù)生長期即進行實驗。接種于培養(yǎng)瓶、96孔板用于實驗。

1.3 MTT法 將細胞分為 4組，對照組、6-OHDA組、PD98059+6-OHDA組、U0126+6-OHDA組。將PC12細胞的單細胞懸液以2×104個/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板中。對照組加入維生素C溶液，6-OHDA組加入6-OHDA，使6-OHDA終濃度分別為 25、50、100、150、200 和 400 μmol/L，U0126+6-OHDA組加入U0126(10 nmol/L)處理1 h后加入6-OHDA終濃度為100 μmol/L，PD98059+6-OHDA 組加入 PD98059處理 1 h加入6-OHDA 終濃度為 100 μmol/L，于 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。給藥后于第24小時檢測。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37℃繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)后，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min，以終止反應并充分溶解甲臜顆粒。選擇570 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值(OD)，實驗組與對照組均設5個復孔，采用組間比較的t檢驗法進行統(tǒng)計學分析。整個實驗重復3次。

1.4 免疫印跡法檢測ERK1/2和磷酸化ERK1/2表達 實驗設正常對照組和 6-OHDA(100 μmol/L)處理 2、6、12、24、48 h組，以及U0126+6-OHDA組和PD98059+6-OHDA組。處理后收集細胞，離心 10 min，以PBS洗2次，用100 μl細胞裂解液于冰浴裂解1 h，離心5 min，收集上清。經(jīng)BCA法進行蛋白定量后以10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質。電泳后將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后，分別加入1∶1 000稀釋的鼠抗人ERK1/2、單克隆抗體，以1∶1 000稀釋的兔抗人p-ERK1/2多克隆抗體，GAPDH作為內參照，4℃培育過夜，PBST洗滌3次，加1∶5 000稀釋的熒光標記二抗，37℃反應1 h，TBST洗滌3次，采用Odyssey雙色紅外線熒光成像系統(tǒng)(LI-COR公司)掃描圖像入計算機，并進行分析。實驗重復3次。

1.5 Hoechst 33258染色 按前述方法培養(yǎng)PC12細胞，并用6-OHDA處理，于培養(yǎng)后24 h進行檢測。將生長良好的PC12細胞用D-Hanks液清洗2次，在細胞培養(yǎng)皿上直接染色，加入Hoeehst33258(終濃度為10 mg/ml)，37℃染色10 min。清洗5次，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗和方差分析。

2 結果

2.1 6-OHDA作用后PC12細胞觀察 6-OHDA作用后PC12細胞的相差顯微鏡圖片顯示，正常對照組的細胞胞膜完整，胞質豐富，細胞連接廣泛，可見細胞突起;隨著6-OHDA劑量的加大，細胞數(shù)目和細胞間連接胞質濃縮與胞膜破裂、胞質內容物外溢逐漸增多，6-OHDA的高劑量組活細胞數(shù)目少，細胞間連接中斷，細胞腫脹和細胞皺縮并存。見圖1。

圖1 6-OHDA作用后PC12細胞形態(tài)觀察(×100)

2.2 MTT法檢測6-OHDA對 PC12細胞的作用 25、50、100、150、200和400 μmol/L 6-OHDA分別與 PC12細胞共同孵育24 h后，細胞存活率分別為:(0.683±0.039)、(0.597±0.054)、(0.482±0.009)、(0.403±0.010)、(0.068±0.008)、(0.019±0.004)，逐漸降低并呈劑量依賴性。同一時間，藥物濃度越大，細胞活性下降越明顯。6-OHDA處理24 h后半數(shù)致死量107 μmol/L，以后實驗我們應用6-OHDA的濃度為100 μmol/L。濃度為200 μmol/L和400 μmol/L時，細胞存活率進一步降低與對照組相比差異非常顯著(P＜0.05)。

圖2 6-OHDA作用后PC12細胞ERK1/2的表達

2.3 6-OHDA對PC12細胞ERK1/2和p-ERK1/2表達的影響

6-OHDA作用后PC12細胞ERK1/2磷酸化蛋白電泳結果見圖2。6-OHDA 作用后 PC12細胞 2、6、12、24 h及 48 h后，ERK1/2蛋白磷酸化水平開始明顯變化，分別為:(1.114±0.199)、(1.171±0.128)、(0.887 ±0.091)、(1.097 ±0.164)、(0.776±0.052)，2 h ERK1/2磷酸化開始明顯升高(P＜0.01)，且一直持續(xù)到48 h仍然有較高水平磷酸化，對照組為(0.332±0.046)。

2.4 U0126，PD98059減輕ERK1/2磷酸化和PC12細胞損傷

提前1 h加入U0126和PD98059可以分別減輕6-OHDA(100 μmol/L)對PC12細胞的毒性作用，PC12細胞生存率分別為:(0.589±0.063)和(0.622±0.047)，較單用6-OHDA引起的細胞生存率明顯增加〔(0.486±0.045)，P＜0.05〕，而U0126和PD98059兩者之間無統(tǒng)計學意義。U0126和PD98059對PC12細胞有保護作用(F=142.565，P=0.000)。見圖3。

圖3 U0126，PD98059對6-OHDA作用PC12細胞ERK1/2磷酸化變化

3 討論

6-OHDA是多巴胺能神經(jīng)遞質的羥基化衍生物，其結構與多巴胺類似，通過自氧化產(chǎn)生泛醌和一系列氧自由基，如過氧化氫(H2O2)，啟動細胞氧化應激，引起多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，常用于制造體內外模型研究PD神經(jīng)變性的潛在機制。PC12細胞來源于大鼠嗜鉻細胞瘤的無性系，當生長在血清充足的培養(yǎng)基時擁有正常嗜鉻細胞的許多特征，如能合成多巴胺和去甲腎上腺素。PC12細胞擁有多一種多巴胺轉運體，可以向細胞內轉運6-OHDA和多巴胺。6-OHDA通過調整細胞信號傳導通路引起氧化應激而致病。因而我們選取PC12細胞和6-OHDA為研究對象，通過探討6-OHDA的細胞毒性可能的信號轉導位點并進行干預研究。

ERK1/2是細胞信號傳導通路中的重要成員，其活化在細胞增殖和分化等關鍵過程中發(fā)揮了重要的作用，一直以來被認為是起保護作用的激酶，很多神經(jīng)保護/營養(yǎng)因子，如腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子及膠質細胞系神經(jīng)營養(yǎng)因子，主要通過ERK傳遞信號，后者經(jīng)歷雙磷酸化而活化，經(jīng)核轉位發(fā)揮保護多巴胺能神經(jīng)的作用〔2〕，產(chǎn)生諸如分化、神經(jīng)保護等有益反應。但是近年來有研究表明，6-OHDA可以誘導線粒體ERK1/2激活〔3〕同時還發(fā)現(xiàn)在SH-SY5Y細胞系中6-OHDA可誘導線粒體內ERK2活化后導致細胞自噬死亡〔4〕。因此認為它與細胞損傷密切相關，我們發(fā)現(xiàn)6-OHDA還誘導ERK1/2在PC12細胞胞漿中持續(xù)激活，可直接導致對多巴胺能神經(jīng)元的毒性這與國外一些研究和我們以往的研究結果相符合〔5，6〕，但6-OHDA如何誘發(fā)持續(xù)性ERK1/2磷酸化尚待進一步探討。

本文結果提示ERK1/2活化可能參與6-OHDA介導的PC12細胞損傷過程。當然PD的病理過程復雜，是多因素共同作用的結果，除ERK1/2因素外，是否還有其他因素和途徑共同影響神經(jīng)元變性損傷尚未完全清楚。ERK1/2通路具體傳導因素也還有待進一步研究。

1 Cagnol S，Chambard J.ERK and cell death:mechanisms of ERK-induced cell death-apoptosis，autophagy and senescence〔J〕.FEBS，2010;277(1):2-21.

2 Choi-Lundberg D，Lin Q，Chang Y，et al.Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy〔J〕.Science，1997;275(5301):838 41.

3 Kulich SM，Horbinski C，Patel M，et al.6-Hydroxydopamine induces mitochondrial ERK activation〔J〕.Free Radic Biol Med，2007;43(3):372-83.

4 Dagda RK，Zhu J，Kulich SM，et al.Mitochondrially localized ERK2 regulates mitophagy and autophagic cell stress:implications for Parkinson's disease〔J〕.Autophagy，2008;4(6):770-82.

5 Jun Chen，Milan Rusnak，Paul J，et al.Dopamine promotes striatal neuronal apoptotic death via ERK signaling cascades〔J〕.Eur J Neurosci，2009;29(2):287-306.

6 范 鷹，張一娜，張艷橋，等.蛋白激酶C亞型磷酸化參與6羥基多巴胺對SH-SY5Y細胞的毒性作用〔J〕.中華醫(yī)學雜志，2006;86(45):3173-76.