李 靜 張一娜 范 鷹 馬 蘭 姜禮紅 崔 璨 吳 博

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院老年病科，黑龍江 哈爾濱 150086)

由于帕金森病(PD)的復(fù)雜性目前尚未發(fā)現(xiàn)理想的治療方法，以阻止神經(jīng)元退行性變，修復(fù)已損傷的神經(jīng)元，臨床上只能針對(duì)癥狀進(jìn)行對(duì)癥治療，因此對(duì)帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究依然非常重要。MAPK家族重要成員細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)研究得最早最深入。它在細(xì)胞分化、發(fā)育、存活及死亡等生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。但ERK1/2在細(xì)胞凋亡性死亡時(shí)的變化及其意義卻存在爭(zhēng)議〔1〕。因此本研究擬在6-OHDA致PC12細(xì)胞損傷模型上，觀察ERK通路的表達(dá)，并引入特異性的抑制劑U0126和PD98059以探討ERK通路在帕金森病發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細(xì)胞，胎牛血清、DMEM(美國(guó)Invitrogen公司)，6-OHDA、MTT、U0126 和 PD98059(英國(guó) Sigma-Aldrich 公司)，一抗總 ERK1/2(L34F12，鼠單克隆)，p-ERK1/2(Thr202/Tyr204，兔多克隆)(美國(guó)CST公司)，Odyssey IRDye 800 nm熒光抗兔二抗、Odyssey IRDye 700 nm熒光抗鼠二抗(美國(guó)Li-COR Biosciences公司)，Hoechst 33258染色試劑盒購(gòu)自碧云天公司。其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的PC12細(xì)胞，接種于含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液并傳代。用0.05%的胰蛋白酶消化使細(xì)胞從瓶壁上分離下來(lái)，以1∶3～1∶4傳代，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。接種于培養(yǎng)瓶、96孔板用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法 將細(xì)胞分為 4組，對(duì)照組、6-OHDA組、PD98059+6-OHDA組、U0126+6-OHDA組。將PC12細(xì)胞的單細(xì)胞懸液以2×104個(gè)/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板中。對(duì)照組加入維生素C溶液，6-OHDA組加入6-OHDA，使6-OHDA終濃度分別為 25、50、100、150、200 和 400 μmol/L，U0126+6-OHDA組加入U(xiǎn)0126(10 nmol/L)處理1 h后加入6-OHDA終濃度為100 μmol/L，PD98059+6-OHDA 組加入 PD98059處理 1 h加入6-OHDA 終濃度為 100 μmol/L，于 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。給藥后于第24小時(shí)檢測(cè)。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37℃繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min，以終止反應(yīng)并充分溶解甲臜顆粒。選擇570 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值(OD)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，采用組間比較的t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 免疫印跡法檢測(cè)ERK1/2和磷酸化ERK1/2表達(dá) 實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組和 6-OHDA(100 μmol/L)處理 2、6、12、24、48 h組，以及U0126+6-OHDA組和PD98059+6-OHDA組。處理后收集細(xì)胞，離心 10 min，以PBS洗2次，用100 μl細(xì)胞裂解液于冰浴裂解1 h，離心5 min，收集上清。經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白定量后以10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后，分別加入1∶1 000稀釋的鼠抗人ERK1/2、單克隆抗體，以1∶1 000稀釋的兔抗人p-ERK1/2多克隆抗體，GAPDH作為內(nèi)參照，4℃培育過夜，PBST洗滌3次，加1∶5 000稀釋的熒光標(biāo)記二抗，37℃反應(yīng)1 h，TBST洗滌3次，采用Odyssey雙色紅外線熒光成像系統(tǒng)(LI-COR公司)掃描圖像入計(jì)算機(jī)，并進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Hoechst 33258染色 按前述方法培養(yǎng)PC12細(xì)胞，并用6-OHDA處理，于培養(yǎng)后24 h進(jìn)行檢測(cè)。將生長(zhǎng)良好的PC12細(xì)胞用D-Hanks液清洗2次，在細(xì)胞培養(yǎng)皿上直接染色，加入Hoeehst33258(終濃度為10 mg/ml)，37℃染色10 min。清洗5次，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 6-OHDA作用后PC12細(xì)胞觀察 6-OHDA作用后PC12細(xì)胞的相差顯微鏡圖片顯示，正常對(duì)照組的細(xì)胞胞膜完整，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞連接廣泛，可見細(xì)胞突起;隨著6-OHDA劑量的加大，細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞間連接胞質(zhì)濃縮與胞膜破裂、胞質(zhì)內(nèi)容物外溢逐漸增多，6-OHDA的高劑量組活細(xì)胞數(shù)目少，細(xì)胞間連接中斷，細(xì)胞腫脹和細(xì)胞皺縮并存。見圖1。

圖1 6-OHDA作用后PC12細(xì)胞形態(tài)觀察(×100)

2.2 MTT法檢測(cè)6-OHDA對(duì) PC12細(xì)胞的作用 25、50、100、150、200和400 μmol/L 6-OHDA分別與 PC12細(xì)胞共同孵育24 h后，細(xì)胞存活率分別為:(0.683±0.039)、(0.597±0.054)、(0.482±0.009)、(0.403±0.010)、(0.068±0.008)、(0.019±0.004)，逐漸降低并呈劑量依賴性。同一時(shí)間，藥物濃度越大，細(xì)胞活性下降越明顯。6-OHDA處理24 h后半數(shù)致死量107 μmol/L，以后實(shí)驗(yàn)我們應(yīng)用6-OHDA的濃度為100 μmol/L。濃度為200 μmol/L和400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低與對(duì)照組相比差異非常顯著(P＜0.05)。

圖2 6-OHDA作用后PC12細(xì)胞ERK1/2的表達(dá)

2.3 6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞ERK1/2和p-ERK1/2表達(dá)的影響

6-OHDA作用后PC12細(xì)胞ERK1/2磷酸化蛋白電泳結(jié)果見圖2。6-OHDA 作用后 PC12細(xì)胞 2、6、12、24 h及 48 h后，ERK1/2蛋白磷酸化水平開始明顯變化，分別為:(1.114±0.199)、(1.171±0.128)、(0.887 ±0.091)、(1.097 ±0.164)、(0.776±0.052)，2 h ERK1/2磷酸化開始明顯升高(P＜0.01)，且一直持續(xù)到48 h仍然有較高水平磷酸化，對(duì)照組為(0.332±0.046)。

2.4 U0126，PD98059減輕ERK1/2磷酸化和PC12細(xì)胞損傷

提前1 h加入U(xiǎn)0126和PD98059可以分別減輕6-OHDA(100 μmol/L)對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用，PC12細(xì)胞生存率分別為:(0.589±0.063)和(0.622±0.047)，較單用6-OHDA引起的細(xì)胞生存率明顯增加〔(0.486±0.045)，P＜0.05〕，而U0126和PD98059兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。U0126和PD98059對(duì)PC12細(xì)胞有保護(hù)作用(F=142.565，P=0.000)。見圖3。

圖3 U0126，PD98059對(duì)6-OHDA作用PC12細(xì)胞ERK1/2磷酸化變化

3 討論

6-OHDA是多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)的羥基化衍生物，其結(jié)構(gòu)與多巴胺類似，通過自氧化產(chǎn)生泛醌和一系列氧自由基，如過氧化氫(H2O2)，啟動(dòng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，引起多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，常用于制造體內(nèi)外模型研究PD神經(jīng)變性的潛在機(jī)制。PC12細(xì)胞來(lái)源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤的無(wú)性系，當(dāng)生長(zhǎng)在血清充足的培養(yǎng)基時(shí)擁有正常嗜鉻細(xì)胞的許多特征，如能合成多巴胺和去甲腎上腺素。PC12細(xì)胞擁有多一種多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)6-OHDA和多巴胺。6-OHDA通過調(diào)整細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路引起氧化應(yīng)激而致病。因而我們選取PC12細(xì)胞和6-OHDA為研究對(duì)象，通過探討6-OHDA的細(xì)胞毒性可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)位點(diǎn)并進(jìn)行干預(yù)研究。

ERK1/2是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要成員，其活化在細(xì)胞增殖和分化等關(guān)鍵過程中發(fā)揮了重要的作用，一直以來(lái)被認(rèn)為是起保護(hù)作用的激酶，很多神經(jīng)保護(hù)/營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及膠質(zhì)細(xì)胞系神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，主要通過ERK傳遞信號(hào)，后者經(jīng)歷雙磷酸化而活化，經(jīng)核轉(zhuǎn)位發(fā)揮保護(hù)多巴胺能神經(jīng)的作用〔2〕，產(chǎn)生諸如分化、神經(jīng)保護(hù)等有益反應(yīng)。但是近年來(lái)有研究表明，6-OHDA可以誘導(dǎo)線粒體ERK1/2激活〔3〕同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在SH-SY5Y細(xì)胞系中6-OHDA可誘導(dǎo)線粒體內(nèi)ERK2活化后導(dǎo)致細(xì)胞自噬死亡〔4〕。因此認(rèn)為它與細(xì)胞損傷密切相關(guān)，我們發(fā)現(xiàn)6-OHDA還誘導(dǎo)ERK1/2在PC12細(xì)胞胞漿中持續(xù)激活，可直接導(dǎo)致對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性這與國(guó)外一些研究和我們以往的研究結(jié)果相符合〔5，6〕，但6-OHDA如何誘發(fā)持續(xù)性ERK1/2磷酸化尚待進(jìn)一步探討。

本文結(jié)果提示ERK1/2活化可能參與6-OHDA介導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷過程。當(dāng)然PD的病理過程復(fù)雜，是多因素共同作用的結(jié)果，除ERK1/2因素外，是否還有其他因素和途徑共同影響神經(jīng)元變性損傷尚未完全清楚。ERK1/2通路具體傳導(dǎo)因素也還有待進(jìn)一步研究。

1 Cagnol S，Chambard J.ERK and cell death:mechanisms of ERK-induced cell death-apoptosis，autophagy and senescence〔J〕.FEBS，2010;277(1):2-21.

2 Choi-Lundberg D，Lin Q，Chang Y，et al.Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy〔J〕.Science，1997;275(5301):838 41.

3 Kulich SM，Horbinski C，Patel M，et al.6-Hydroxydopamine induces mitochondrial ERK activation〔J〕.Free Radic Biol Med，2007;43(3):372-83.

4 Dagda RK，Zhu J，Kulich SM，et al.Mitochondrially localized ERK2 regulates mitophagy and autophagic cell stress:implications for Parkinson's disease〔J〕.Autophagy，2008;4(6):770-82.

5 Jun Chen，Milan Rusnak，Paul J，et al.Dopamine promotes striatal neuronal apoptotic death via ERK signaling cascades〔J〕.Eur J Neurosci，2009;29(2):287-306.

6 范 鷹，張一娜，張艷橋，等.蛋白激酶C亞型磷酸化參與6羥基多巴胺對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006;86(45):3173-76.