楊麗麗，趙城彬，吳 非

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)γ-氨基丁酸最適條件的研究

楊麗麗，趙城彬，吳 非*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

使用乳酸菌發(fā)酵米糠，以菌種、菌種添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為單因素研究其對米糠發(fā)酵液中γ-氨基丁酸（GABA）含量的影響，在最適條件下，采用混料設(shè)計(jì)法，使用混合乳酸菌發(fā)酵米糠，以發(fā)酵液中GABA含量為指標(biāo)，確定乳酸菌發(fā)酵米糠的最優(yōu)條件為：在混合菌種嗜熱鏈球菌S1添加量為1.55%，保加利亞乳桿菌L1添加量為1.45%，50℃下發(fā)酵米糠14h，發(fā)酵液中GABA含量最高，為287.975mg/100g。

米糠，乳酸菌，γ-氨基丁酸（GABA）

Abstract：Lactobacillus were used to ferment rice bran.Strains，adding amount of strains，fermentation temperature and fermentation time were used as single factorand their influence on the production of GABA of the fermented rice bran were researched.The mixture design method were used to determine the optimum conditions and mixed lactobacillus were used to fermente rice bran with the number of GABA content for index，lactobacillus ferments rice bran optimal conditions were investigated，the result showed：in the mixed bacteria streptococcus thermophilus cultured S1 add content was 1.55% ，Bulgaria lactobacillus L1 add content was 1.45% ，50℃fermented rice bran 14h，the number of GABA content was highest for 287.975mg/100g.

Key words：rice bran；Lactic acid bacteria；GABA

米糠是稻米碾白加工過程中碾下的皮層、米胚和碎米混合物，米糠中蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸組成豐富，營養(yǎng)全面。尤其是谷氨酸（Glu）的含量很高[1]。Glu為合成γ-氨基丁酸（GABA）的重要原料。GABA作為人體重要的神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、改善腦部血液循環(huán)、安神、健腎、利肝和改善脂質(zhì)代謝等生理作用[2-7]。γ-氨基丁酸同其A型受體在胃癌SGC-7901細(xì)胞的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖的影響、γ-氨基丁酸脂質(zhì)體制備工藝的研究、富γ-氨基丁酸乳酸菌發(fā)酵功能飲料的研制是近些年?duì)I養(yǎng)界和醫(yī)療界共同關(guān)注和研究的一個(gè)熱點(diǎn)課題。GABA天然存在量低，很難從一些天然動植物組織中大量提取分離。目前獲得GABA的方法有化學(xué)合成法和生物法兩大類，其中生物法包括植物富集法和微生物發(fā)酵法2種[8-9]。由于使用具有食品安全的微生物乳酸菌中的谷氨酸脫羧酶催化生產(chǎn)GABA，具有不受資源、環(huán)境和空間的限制等優(yōu)點(diǎn)，而且乳酸菌是一種具有保健作用的益生菌，與食品工藝的關(guān)系密切，因此使用乳酸菌發(fā)酵米糠具有雙重的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；副干酪乳桿菌1.0201、嗜熱鏈球菌S1、保加利亞乳桿菌L1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；GABA標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；其余試劑均為分析純。

722可見光分光光度計(jì) 天津市泰斯特儀器有限公司；pHS-25型pH計(jì) 上海精科雷磁儀器廠；JD500-2型分析天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；HH-4型電熱恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；高速離心機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；超凈工作臺 北京安泰科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌活化 從冷凍保存的3種菌株的凍存管中各取300μL菌液分別接入10mL MRS液體培養(yǎng)基中，40℃下活化培養(yǎng)24h，然后分別吸取1.5mL菌液于50mL MRS培養(yǎng)基中，40℃下培養(yǎng)18h，再分別吸取3mL菌液于100mL MRS培養(yǎng)基中，40℃下培養(yǎng)16h作為種子液。

1.2.2 GABA含量的測定 準(zhǔn)確稱量GABA 2500.000mg于500mL容量瓶中用蒸餾水溶解、定容為5.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)準(zhǔn)確配制0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。然后分別從配制好的0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液中取出1.00mL，再依次加入0.01mol/L四硼酸鈉緩沖液1.0mL，6%苯酚溶液1.0mL，7.5%次氯酸鈉溶液1mL，混勻，沸水浴10min，立即冰浴5min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入60%乙醇溶液2.0mL后于645nm下測定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立回歸方程。樣品發(fā)酵后，在12000r/min下離心15min，取發(fā)酵米糠上清液1.00mL進(jìn)行比色法測定，測定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制時(shí)所用方法。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵米糠條件的優(yōu)化 分別稱取1g米糠于3只15mL發(fā)酵管中，分別加入10mL蒸餾水混勻，放入高壓蒸汽滅菌鍋中115℃滅菌15min，待試管溫度降至30℃左右時(shí)，在無菌超凈臺中接入種子液進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.3.1 發(fā)酵溫度對GABA產(chǎn)量的影響 在菌種添加量為2%的條件下，用副干酪乳桿菌1.0201發(fā)酵米糠，設(shè)定發(fā)酵溫度分別為35、40、45、50、55℃，在此條件下發(fā)酵12h，比色法測發(fā)酵液中GABA含量，選取最佳發(fā)酵溫度。

1.2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對GABA產(chǎn)量的影響 在菌種添加量為2%、發(fā)酵液溫度50℃的條件下，用副干酪乳桿菌1.0201發(fā)酵米糠，分別發(fā)酵10、12、14、16、18h，比色法測發(fā)酵液中GABA含量，選取最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.3.3 菌種添加量對GABA產(chǎn)量的影響 以副干酪乳桿菌1.0201發(fā)酵米糠，在發(fā)酵液溫度50℃，菌種的添加量分別1%、2%、3%、4%、5%的條件下發(fā)酵14h，比色法測發(fā)酵液中GABA含量，選取菌種最佳添加量。

1.2.3.4 乳酸菌類型對GABA產(chǎn)量的影響 在菌種添加量為3%，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時(shí)間14h的條件下，分別使用副干酪乳桿菌1.0201、嗜熱鏈球菌S1、保加利亞乳桿菌L1發(fā)酵米糠，比色法測發(fā)酵液中GABA含量，選取最佳發(fā)酵菌種。

1.2.3.5 混合乳酸菌對GABA產(chǎn)量的影響 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上以發(fā)酵溫度50℃、發(fā)酵時(shí)間14h、混合菌種添加量3%為固定參數(shù)，采用混料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)[10-12]，使用混合乳酸菌發(fā)酵米糠，以A（副干酪乳桿菌添加量，%）、B（嗜熱鏈球菌添加量，%）、C（保加利亞乳桿菌添加量，%）分別代表的因素為自變量，以GABA含量為因變量，來確定混合乳酸菌的配比的因素水平編碼表，見表1。

1.2.3.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過對混合菌不同配比發(fā)酵參數(shù)對考察指標(biāo)影響的混料實(shí)驗(yàn)研究，得到了產(chǎn)GABA的優(yōu)化值。在考察指標(biāo)最優(yōu)的混合菌發(fā)酵工藝條件下，進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取平均值，比對在最優(yōu)混合菌發(fā)酵條件下各考察指標(biāo)的驗(yàn)證值與預(yù)測值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差是否在合理范圍內(nèi)。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 單因素實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖分析；混料設(shè)計(jì)使用Design Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌1.0201發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA的研究

實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線、發(fā)酵溫度、時(shí)間、菌種添加量對副干酪乳桿菌1.0201發(fā)酵米糠發(fā)酵液中GABA含量的影響的測定結(jié)果分別見圖1～圖4。

圖1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 GABA standard curve

圖2 溫度對GABA含量的影響Fig.2 The influence of temperature on GABA content

圖3 時(shí)間對GABA含量的影響Fig.3 The influence of time on GABA content

圖4 菌種添加量對GABA含量的影響Fig.4 The influence of adding amount of strains on GABA content

圖1經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.6993x-0.0418，相關(guān)系數(shù)R2=0.9982；圖2發(fā)酵溫度對GABA產(chǎn)量影響的結(jié)果為，50℃時(shí)發(fā)酵液中GABA含量最高，達(dá)248.55mg/100g；圖3發(fā)酵時(shí)間對GABA產(chǎn)量影響的結(jié)果為，14h發(fā)酵液中GABA含量最高，達(dá)268.55mg/100g；圖4菌種的添加量對GABA產(chǎn)量影響的結(jié)果，可以看出其添加量為3%時(shí)發(fā)酵液中GABA含量最高，達(dá)277.13mg/100g。

2.2 乳酸菌類型發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA的研究

在菌種添加量為3%，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時(shí)間14h的條件下，三種乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA的研究結(jié)果見圖5。

圖5 乳酸菌類型對GABA產(chǎn)量的影響Fig.5 The influence on GABA production of Lactic acid bacteria types

由圖5可以看出，三種乳酸菌發(fā)酵米糠中，保加利亞乳桿菌L1發(fā)酵液中GABA含量最高，達(dá)282.85mg/100g。

2.3 混合乳酸菌對GABA產(chǎn)量的影響

混料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 混料設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Mixture design results

通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立回歸模型如下：

回歸方程可信度分析見表3。其中，R2=0.9156，表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋，說明方程可靠性較高。CV值越低，顯示實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性越好。該實(shí)驗(yàn)的CV值為2.76%，較低，說明實(shí)驗(yàn)操作可信。

表3 回歸方程可信度及方差分析結(jié)果Table 3 Creditability of regression equations

采用Design-Expert軟件對模型方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 4 Regression equation of the results of variance analysis

由表4可知，線性混合對R值的影響顯著（“Prob＞F”值＜0.05），表明方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯。然而AC和BC對響應(yīng)值影響也顯著，說明實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。該模型回歸顯著（“Prob＞F”值＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（“Prob＞F”值＞0.05），說明該模型能很好地?cái)M合各指標(biāo)與混合菌比例。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為：BC＞AC＞AB，即嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌混合作用發(fā)酵＞副干酪乳桿菌與保加利亞乳桿菌混合作用發(fā)酵＞副干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合作用發(fā)酵。

混料設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果與響應(yīng)面分析圖，見圖6～圖7。

圖6 混料設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果圖Fig.6 Optimization results of mixing design

圖7 響應(yīng)面分析結(jié)果Fig.7 The response surface GABA

響應(yīng)面可以直接反映出各因子對響應(yīng)值的影響大小，通過優(yōu)化結(jié)果可以直接看出最優(yōu)條件下各因子的取值范圍。由圖7以及表4可知，副干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合作用發(fā)酵對GABA含量的提高不明顯，通過混料設(shè)計(jì)結(jié)果的優(yōu)化和響應(yīng)面分析可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，副干酪乳桿菌添加量X（A）、嗜熱鏈球菌添加量X2（B）和保加利亞乳桿菌添加量X3（C）對應(yīng)的編碼值分別為0、0.516和0.484時(shí)，GABA含量有較大值在296.893mg/100g左右。與其對應(yīng)的混合菌種最佳添加量為：嗜熱鏈球菌添加量為1.55%，保加利亞乳桿菌添加量為1.45%。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過混合菌不同配比參數(shù)對各考察指標(biāo)影響的混料實(shí)驗(yàn)研究，得到了乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)GABA的優(yōu)化值。在混合乳酸菌的最優(yōu)配比條件下，進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取平均值，結(jié)果為各考察指標(biāo)的驗(yàn)證值287.975mg/100g與預(yù)測值296.893mg/100g之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差均在合理范圍內(nèi)，說明響應(yīng)值的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值吻合良好。

3 結(jié)論

由單因素對GABA產(chǎn)量的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在菌種添加量為3%、發(fā)酵溫度50℃、發(fā)酵時(shí)間14h的條件下，保加利亞乳桿菌L1發(fā)酵液中GABA含量最高，達(dá)282.85mg/100g。而在同等條件下，利用混料設(shè)計(jì)后混合乳酸菌發(fā)酵米糠以嗜熱鏈球菌S1添加量為1.55%，保加利亞乳桿菌L1添加量為1.45%時(shí)，最終發(fā)酵液中GABA含量達(dá)287.975mg/100g，高于任何單一菌液發(fā)酵米糠時(shí)發(fā)酵液中GABA的產(chǎn)量，即在混合菌同時(shí)使用時(shí)GABA的含量得到了進(jìn)一步的富集，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)的目的。

米糠價(jià)格低廉，發(fā)酵工藝簡單，生產(chǎn)周期短，其發(fā)酵產(chǎn)物可進(jìn)行后續(xù)處理，如GABA的提取或者富含GABA食品的開發(fā)等，預(yù)期會具有較好的市場前景。

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Study on Lactobacillus fermentation in rice bran production gamma-aminobutyric optimal conditions

YANG Li-li，ZHAO Cheng-bin，WU Fei*
（Institute of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

TS210.1

A

1002-0306（2012）16-0217-04

2011-12-01 *通訊聯(lián)系人

楊麗麗（1985-），女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C200942）。