付冠華，李 端，周晨妍

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，河南省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與分子靶向藥物高校重點實驗室培育基地，河南新鄉(xiāng) 453003）

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-1基因克隆和序列分析

付冠華，李 端，周晨妍*

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，河南省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與分子靶向藥物高校重點實驗室培育基地，河南新鄉(xiāng) 453003）

利用RT-PCR技術(shù)從黑曲霉XZ-3S中擴(kuò)增并克隆了木聚糖酶（Xyn ZF-1）基因的cDNA片段，測序結(jié)果表明，Xyn ZF-1基因核苷酸序列閱讀框全長678bp，編碼225個氨基酸，推測分子量為24.06ku，等電點為5.20。以XZ-3S基因組DNA為模板擴(kuò)增Xyn ZF-1的DNA序列，該序列僅存在一個內(nèi)含子，長度為68bp。成熟肽基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他微生物來源的木聚糖酶一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，同源性最高達(dá)到了89.47%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析該酶屬于G/11族糖基水解酶。又進(jìn)一步對Xyn ZF-1二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并通過SWISS-MODEL預(yù)測了該酶的三維結(jié)構(gòu)。

黑曲霉，木聚糖酶，基因克隆，序列分析

Abstract：The cDNA of xylanase（Xyn ZF-1） gene was amplified from the Aspergillus niger XZ-3S total RNA by RT-PCR.The result showed that Xyn ZF-1 was 678bp in size and encoded 225 amino acids.The molecular weight and theoretical isoelectric point was 24.06ku and 5.20，respectively.The DNA of Xyn ZF-1 gene was amplified from the Aspergillus niger XZ-3S genmic DNA by PCR.The result confirmed that there was only one intron with the 68bp in length.The homology analysis of amino acid sequence shared 89.47%in base sequence with other microbial xylanase primary structure.Phylogenetic analysis showed that the enzyme belongd to glycosyl hydrolase family G/11.Besides，the secondary structure of Xyn ZF-1 was analysed，and threedimensional structure of Xyn ZF-1 was predicted by SWISS-MODEL.

Key words：Aspergillus niger；Xylanase；gene cloning；sequence analysis

木聚糖（Xylan）是植物半纖維素的主要成分，是僅次于纖維素的第二豐富的可再生資源。木聚糖結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，它的完全降解需要多種水解酶的參與而共同完成，其中β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶（EC 3.2.1.8）能夠以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈產(chǎn)生不同長度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶[1-2]。木聚糖酶被廣泛地應(yīng)用于造紙、食品、飼料等行業(yè)中，尤其是當(dāng)今世界能源日益緊缺，如何有效利用資源越來越受到人們的關(guān)注[1，3]。根據(jù)木聚糖酶催化區(qū)域的氨基酸序列組成和疏水簇分析，可將其歸為F/10和G/11兩大家族，同一家族中的木聚糖酶催化區(qū)域具有較高的同源性。G/11木聚糖酶多為單結(jié)構(gòu)域，相對分子質(zhì)量一般在19～25ku，酶最適溫度50～60℃，有一個β-膠狀卷曲結(jié)構(gòu)；F/10木聚糖酶則含有較多結(jié)構(gòu)域，不僅有催化結(jié)構(gòu)域，還存在纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Cellulose Binding Domain：CBD），相對分子質(zhì)量一般大于30ku，酶最適溫度60～80℃，有一個（αβ）8桶狀結(jié)構(gòu)[4-6]。Bernier等首次從Bacillus subtillis PAP II 5中分離得到木聚糖酶基因（Xyn）以來，Maconukul等[7-9]先后克隆并分析了來自細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母菌和藻類等300多種不同生物來源的木聚糖酶基因，其中上百種基因在不同宿主中進(jìn)行了表達(dá)。張茂等[10]從黑曲霉GIM3.452中克隆得到木聚糖酶XynA的成熟肽編碼序列，并將其片段插入真核表達(dá)載體，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下成功將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入PK15細(xì)胞，最終實現(xiàn)了異源基因分泌表達(dá)。黑曲霉XZ-3S是本實驗室保藏的一株高產(chǎn)木聚糖酶菌株。本研究旨在克隆Xyn ZF-1基因，并對該基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行詳盡的分析，為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能和工程菌的構(gòu)建奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌大腸桿菌（Escherichia coli）JM109 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系酶與發(fā)酵工程實驗室保存；TA克隆載體pUCm-T質(zhì)粒、RNA分離TRIzol試劑、飽和酚、氨芐青霉素（Amp） Sangon公司；TaKaRa RNA PCR試劑盒（AMV）Ver.3.0、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、蛋白酶K、IPTG、X-galTaKaRa生物工程（大連）有限公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒 生工生物工程（上海）有限公司；DNA MarkerMBI公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖 BBI公司；溴化乙錠 Amresco公司；其他主要生化試劑 為進(jìn)口產(chǎn)品或國產(chǎn)分析純；P1、P2、P3引物 由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成。

L-Broth（LB） 蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母粉5g/L，pH7.4；用于培養(yǎng)含Ampr質(zhì)粒的E.coli時，添加Amp濃度為100μg/mL；LB固體培養(yǎng)基，添加20g/L的瓊脂粉；黑曲霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基 蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖10g/L，200mL/L的玉米芯提取液[11]，自然pH。發(fā)酵條件：28℃，110r/min，培養(yǎng)36h，收集菌體用于XZ-3S總RNA，總基因組DNA提取。

梯度PCR擴(kuò)增儀C1000 Bio-Rad Laboratory；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-2） 北京市六一儀器廠；Touching 956數(shù)碼相機(jī)凝膠成像系統(tǒng) 上海天呈科技有限公司；恒溫振蕩器（HZQ-F160A） 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；低溫恒溫槽（DC-0506） 上海比朗儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（Neofuge 23R） 上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計、合成 通過對GenBank中真菌木聚糖酶相關(guān)基因的比較，以起始密碼子和終子密碼子附近相似度較高序列為參照，設(shè)計了以下引物：

上游引物

下游引物

1.2.2 黑曲霉總RNA和基因組DNA的提取 黑曲霉培養(yǎng)液經(jīng)抽濾、無菌水洗滌菌體數(shù)次，采用TRIzol試劑一步法提取總RNA，具體操作參照TRIzol使用說明書。通過測定A260/A280，檢測RNA提取的純度。黑曲霉基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[12]。

1.2.3 目的基因的擴(kuò)增

1.2.3.1 RT-PCR擴(kuò)增cDNA片段 在反應(yīng)體系中以總RNA為模板，具體反應(yīng)體系為：MgCl22μL，10×RT Buffer 1μL，RNase Free dH2O 3.75μL，dNTP Mixture 1μL， RNase Inhibitor0.25μL， AMV Reverse Transcriptase 0.5μL，Oligo dT-Adaptor Primer 0.5μL，總RNA 1μL，共10μL；反應(yīng)條件為：50℃ 30min，99℃5min，5℃ 5min。具體反應(yīng)液配制及反應(yīng)條件參見TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒說明書。

在PCR反應(yīng)體系中，以cDNA第一條鏈為模板，具體反應(yīng)體系為：5×PCR Buffer 10μL，滅菌蒸餾水28.75μL，TaKaRa Ex Taq? HS 0.25μL，5’端引物P1 0.5μL，3’端引物M13 0.5μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 10μL，共50μL；反應(yīng)條件為：94℃ 2min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增基因組DNA片段 以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，其反應(yīng)體系組成為：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，無菌水19μL，Taq酶0.5μL，5’端引物P1 0.5μL，3’端引物P3 0.5μL，DNA 1μL，共25μL；反應(yīng)條件為：95℃ 10min；94℃ 30s，52℃ 45s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增完畢，取樣用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 回收產(chǎn)物驗證

1.2.4.1 總RNA擴(kuò)增產(chǎn)物驗證 以總RNA膠回收產(chǎn)物為模板，分別以P1/M13、P1/P3、P2/P3為引物，PCR擴(kuò)增相應(yīng)DNA片段。反應(yīng)體系：DNA 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，Taq酶0.5μL，無菌水19μL，共25μL；反應(yīng)條件為：94℃ 2min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增完畢，分別取樣用1.0%的瓊脂糖凝膠驗證擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4.2 基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物驗證 以基因組DNA膠回收產(chǎn)物為模板，分別以P1/P3、P2/P3為引物，PCR擴(kuò)增相應(yīng)DNA片段。PCR反應(yīng)體系：DNA 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，Taq酶0.5μL，無菌水19μL，共25μL；反應(yīng)條件為：95℃ 8min；94℃ 30s，52℃ 45s，72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增完畢，分別取樣用1.0%的瓊脂糖凝膠驗證擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.5 連接反應(yīng) 連接體系：膠回收產(chǎn)物7μL，pUCm-T質(zhì)粒1μL，10×T4 DNA Ligase Buffer1μL，T4 DNA Ligase 1μL，共10μL；連接條件：16℃過夜。

1.2.6 重組質(zhì)粒的篩選及鑒定 各取5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μL感受態(tài)細(xì)胞JM109，然后涂在含Amp、IPTG、X-gal的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取白色克隆提取質(zhì)粒，同時以藍(lán)色質(zhì)粒為對照。以白色重組質(zhì)粒為模板做PCR（參照1.2.3），擴(kuò)增、電泳回收目的片段，然后以膠回收產(chǎn)物為模板做PCR驗證（參照1.2.4）。

1.2.7 序列測定及序列分析 將新鮮菌液送金唯智生物科技（北京）有限公司進(jìn)行目的片段的雙向測序，測序結(jié)果利用Vector NTI 9.0軟件進(jìn)行序列拼接；序列的同源性比較用DNAMAN5.0軟件處理，并將翻譯后的氨基酸序列遞交至http：//swissmodel.expasy.org/tools/中進(jìn)行Xyn ZF-1的氨基酸序列分析、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及三維結(jié)構(gòu)的同源建模。

2 結(jié)果與討論

2.1 木聚糖酶Xyn ZF-1 cDNA片段的擴(kuò)增與克隆

圖1 Xyn ZF-1 cDNA的凝膠電泳Fig.1 Analysis of Xyn-ZF-1 cDNA fragment amplified by PCR

圖2 pUCm-T-Xyn ZF-1陽性克隆的PCR驗證Fig.2 Identification of the recombinant plasmid by PCR

根據(jù)引物設(shè)計時參照Genbank中基因的大小和PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1）割膠回收800bp左右的條帶（圖1第1泳道），利用T-A克隆策略將該cDNA片段直接克隆到pUCm-T vector中，連接轉(zhuǎn)化E.coli JM109，藍(lán)白斑篩選，挑取重組子，經(jīng)PCR鑒定，證明所插入片段與擴(kuò)增片段長度相同（圖2），送樣測定核苷酸序列。

2.2 木聚糖酶Xyn ZF-1 DNA片段的擴(kuò)增克隆

圖3 Xyn ZF-1 DNA的凝膠電泳Fig.3 Analysis of Xyn-ZF-1 DNA fragment amplified by PCR

圖4 pUCm-T-Xyn ZF-1陽性克隆的PCR驗證Fig.4 Identification of the recombinant plasmid by PCR

根據(jù)目的基因的大小和PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖3）割膠回收800bp左右的條帶（圖3第1泳道），利用T-A克隆策略將該cDNA片段直接克隆到pUCm-T vector中，連接轉(zhuǎn)化E.coli JM109，藍(lán)白斑篩選，挑取重組子，經(jīng)PCR鑒定，證明所插入片段與擴(kuò)增片段長度相同（圖4），送樣測定核苷酸序列。

2.3 木聚糖酶Xyn ZF-1 cDNA片段的序列分析

圖5 黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-1 cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.5 Partial cDNA and deduced amino acid sequence of Xyn ZF-1 from Aspergillus niger

測序結(jié)果表明，RT-PCR產(chǎn)物全長確實為Xyn ZF-1 cDNA（圖5），該cDNA包含Xyn ZF-1信號肽編碼區(qū)，成熟肽編碼區(qū)，3’非編碼區(qū)和Poly（A）等核苷酸序列。該序列全長785bp（不包括Poly（A）），其中蛋白質(zhì)編碼區(qū)678bp，編碼225個氨基酸，3’非編碼區(qū)107bp。根據(jù)cDNA序列推導(dǎo)出該木聚糖酶的氨基酸序列，共225個氨基酸，推測分子量為24.06ku，等電點為5.20，分子式C1065H1577N283O349S4。

2.4 木聚糖酶Xyn ZF-1 DNA序列分析

圖6 木聚糖酶Xyn ZF-1 DNA序列Fig.6 Xylanase Xyn ZF-1-encoding DNA

Xyn ZF-1序列包括起始位點、內(nèi)含子和外顯子等核苷酸序列，全長746bp。該DNA序列與對應(yīng)的cDNA進(jìn)行序列對比分析，由圖6可知，在Xyn ZF-1 DNA編碼區(qū)僅存在一個內(nèi)含子，長度為68bp。

2.5 黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-1與其他木聚糖酶一級結(jié)構(gòu)的同源性比較

將黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-1成熟肽完整的氨基酸序列與Genbank中其他微生物來源的木聚糖酶一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明，它與G/11族的木聚糖酶具有較高的同源性。圖7表明，Xyn ZF-1與Aspergillus usamii（Genbank登 錄 號 ：AEJ87263）、Chaetomium thermophilum（Genbank登錄號：CAD48750）、Holomastigotoides mirabile（Genbank登錄號：BAH56520）、Penicillium citrinum（Genbank登錄號：BAE71133）4種微生物中的木聚糖酶的同源性比對結(jié)果分別為89.47%、60.77%、56.94%、64.11%?？梢娡茖?dǎo)的木聚糖酶氨基酸序列與Aspergillus usamii序列相似性最高，達(dá)到了89.47%。

圖7 微生物來源的木聚糖酶序列的多重比較Fig.7 Comparison of Xyn ZF-1to other microbial xylanase

2.6 木聚糖酶Xyn ZF-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將Xyn ZF-1成熟肽完整的氨基酸序列與從Genbank中隨機(jī)選取的13種木聚糖酶氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖8），結(jié)果表明，它屬于G/11族糖基水解酶。

2.7 木聚糖酶XynZF-1二級結(jié)構(gòu)分析及三維結(jié)構(gòu)建模

圖8 木聚糖酶一級結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.8 Phylogenetic tree of xylanase gene based on amino acid sequnce annalysis

通過CFSSP（Chou&；FasmanSecondary Structure Prediction Server）方法分析得知，Xyn ZF-1二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋，β-折疊和少量轉(zhuǎn)角構(gòu)成，所占比例分別為32.4%、46.7%和16.0%。三維結(jié)構(gòu)建模顯示Xyn ZF-1具有G/11木聚糖酶典型的β-膠狀卷曲結(jié)構(gòu)（圖9）。

圖9 通過SWISS-MODEL預(yù)測的Xyn ZF-1三維模型Fig.9 Three-dimensional structure of Xyn ZF-1 predicted by SWISS-MODEL

3 結(jié)論

3.1 以黑曲霉XZ-3S總RNA為模板，采用RT-PCR等技術(shù)分別擴(kuò)增和克隆了木聚糖酶（Xyn ZF-1）cDNA的相關(guān)片段，經(jīng)拼接獲得Xyn ZF-1 cDNA的完整序列，該cDNA全長785bp包含了起始密碼子、信號肽編碼區(qū)、成熟肽編碼區(qū)、終止密碼子和3’端非編碼區(qū)等核苷酸序列。

3.2 以黑曲霉XZ-3S基因組DNA為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增和克隆了Xyn ZF-1的DNA相關(guān)片段，經(jīng)拼接得到了Xyn ZF-1 DNA序列。該DNA全長746bp，包含起始密碼子、1個內(nèi)含子和2個外顯子以及終止密碼子等核苷酸序列。內(nèi)含子長度為68bp，位于Gln93第3個和Asp94第1個堿基之間。

3.3 一級結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知，該酶屬于G/11族，且與G/11族中的木聚糖酶有較高的同源性。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測該酶由許多α-螺旋、β-折疊和少量轉(zhuǎn)角構(gòu)成。三維結(jié)構(gòu)建模顯示Xyn ZF-1具有G/11木聚糖酶典型的β-膠狀卷曲結(jié)構(gòu)。

[1]余元莉，李秀婷，宋煥祿，等.微生物木聚糖酶的研究進(jìn)展[J].中國釀造，2009（2）：1-4.

[2]Fan Zhang，Pengjun Shi，Yinguo Bai，et al.An acid and highly thermostable xylanase from Phialophora sp.G5[J].Appl Microbiol Biotechnol，2011，89，1851-1858.

[3]萬紅鬼，武振軍，蔡恒，等.微生物發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志，2010，30（2）：141-146.

[4]Sibtain Ahmed，Saba Riaz，Amer Jamil.Molecular cloning of fungal xylanase：an overview[J].Appl Microbiol Biotechnol，2009，84：19-35.

[5]劉亮偉，楊海玉，胡瑜，等.F/10木聚糖酶研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2009，28（6）：727-732.

[6]Motoki Wakiyama，Koji Yoshihara，Scchio Hayashi，et al.An extracellular endo-1，4-β -xylanase from Aspergillus japonic properties，and characterization of the encoding gene[J].Journal of Bioengineering，2010，109（3）：227-229.

[7]Waconukul Rattiya，Patthra Pason，Khin Lay Kyu，et al.Cloning，Sequencing，and Expression of the Gene Encoding a Multidomain Endo-β-1，4-Xylanasefrom Paenibacillus curdlanolyticus B-6，and Characterization of the Recombinant Enzyme[J].J Microbiol Biotechnol，2009，19（3）：277-285.

[8]周晨妍，符丹丹，鄔敏辰.宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（10）：29-32.

[9]Junqing Wang， Huimin Zhang， Minchen Wu， et al.Cloning and sequence analysis of a novel xylanase gene，Auxyn10A，from Aspergillus usamii[J].Biotechnol Lett，2011，33：1029-1038.

[10]張茂，劉德武，林純，等.黑曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，29（5）：588-592.

[11]姚笛，馬萍，王穎，等.響應(yīng)面法優(yōu)化玉米芯中木聚糖的提取工藝[J].食品科學(xué)，2011，32（8）：111-115.

[12]Wendland J，Lengeler KB，Kothe E.An instant preparation method for mucleic acids of filamentous fungi[J].Fungal Genet Newslett，1996，43：54-55.

Cloning and sequence analysis of the gene encoding xylanase Xyn ZF-1 from Aspergillus niger XZ-3S

FU Guan-hua，LI Duan，ZHOU Chen-yan*
（Key Laboratory of Medical Genetics and Molecular Targeting Drugs，Xinxiang Medical College，Department of Life Science and Technology，Xinxiang 453003，China）

Q789

A

1002-0306（2012）16-0187-05

2012-01-11 *通訊聯(lián)系人

付冠華（1986-），男，碩士研究生，研究方向：微生物酶工程。

河南省教育廳自然研究計劃項目資助（2011A180026）；河南省科技廳科技攻關(guān)項目（112102210299）；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新支持計劃項目（YJSCX201104Z）。