熊珊珊，繆 銘，江 波，*

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

雙酶處理對(duì)玉米淀粉鏈結(jié)構(gòu)和消化性的影響

熊珊珊1，2，繆 銘1，江 波1，*

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

研究雙酶處理形成慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）的精細(xì)結(jié)構(gòu)。采用兩種酶（β-淀粉酶的水解作用和轉(zhuǎn)苷酶的轉(zhuǎn)苷作用）對(duì)玉米淀粉進(jìn)行雙重處理以期提高慢消化淀粉含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)β-淀粉酶水解后的玉米淀粉再經(jīng)轉(zhuǎn)苷酶處理，其鏈長(zhǎng)分布、碘吸附作用和消化性能有了顯著地變化，并且這種變化隨不同的轉(zhuǎn)苷處理時(shí)間而有明顯差異。原淀粉經(jīng)過(guò)β-淀粉酶處理4h，再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)苷酶處理24h后的淀粉樣品SDS最高含量可以達(dá)到13.95%，此時(shí)的樣品平均鏈長(zhǎng)為12.58，分支密度為7.95%。實(shí)驗(yàn)證明酶法改性淀粉可以有效改善淀粉的消化性能。

消化性，鏈長(zhǎng)，分支密度，玉米淀粉

Abstract：Fine structure of slowly digestible starch（SDS） formed during dual-enzymes treatment was investigated.Through the hydrolysis of β-amylase and transglycosylation of transglucosidase，higher amount of SDS could be obtained.The result indicated that the chain length distribution，iodine binding and digestibility of starch samples，which were subjected to different time of transglycosylation following β-hydrolysis，changed obviously.After maize starch being treated by β-amylase for 4h，the highest SDS amount of 13.95%was gained when transglucosidase continued to treat for 24h，the average chain length was 12.58，and branch density was 7.95%.The experiment proved that dual-enzymes treatment could improve the digestibility of maize starch effectively.

Key words：digestibility；chain length；branch density；maize starch

淀粉屬于多聚葡萄糖，其分子式通常表示為（C6H10O5）n，n為不定數(shù)，可以聚合度DP（degree of polymerization）來(lái)表示。淀粉是由直鏈狀和支叉狀兩種分子組成的，脫水葡萄糖單位間經(jīng)α-1，4糖苷鍵連接，稱(chēng)為直鏈淀粉（amylose）；交叉位置是α-1，6糖苷鍵連接，其余為α-1，4糖苷鍵連接，稱(chēng)為支鏈淀粉（amylopectin）。由于淀粉是人類(lèi)膳食中主要的碳水化合物，也是人體能量的主要來(lái)源，淀粉消化的方式和速度對(duì)人體餐后血糖應(yīng)答有著很重要的影響[1-2]，因此改善淀粉的消化利用有著非常大的研究前景。1992年，英國(guó)學(xué)者Englyst[3]等提出在體外模擬的條件下依據(jù)淀粉的生物可利用性將淀粉分為三類(lèi)：易消化淀粉（ready digestible starch，RDS），指那些能在口腔和小腸中被迅速消化吸收的淀粉（＜20min），屬于快速釋放能量的高血糖食品；慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS），指那些能在小腸中被完全消化吸收但速度較慢的淀粉（20～120min），可持續(xù)緩慢釋放能量，維持餐后血糖穩(wěn)態(tài)；抗性淀粉（resistant starch，RS），指在人體小腸內(nèi)無(wú)法消化吸收的淀粉（＞120min），類(lèi)似于膳食纖維只能在大腸中被微生物發(fā)酵利用。Ao[4]等通過(guò)不完全水解淀粉，將支鏈淀粉側(cè)鏈（A鏈與B鏈）和直鏈淀粉的長(zhǎng)度變短，從而使淀粉的分支密度增加，研究此鏈結(jié)構(gòu)變化與和淀粉的消化速率之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)對(duì)淀粉的消化影響很大，而淀粉分支密度的增加和酶處理淀粉的晶體結(jié)構(gòu)與淀粉的慢消化性有密切關(guān)系。β-淀粉酶作為淀粉水解酶，能切斷α-1，4糖苷鍵，順次得到麥芽糖單位，但不能裂開(kāi)支鏈淀粉中的α-1，6糖苷鍵，而轉(zhuǎn)葡糖苷酶（transglucosidase，EC 2.4.1.24）不僅可以催化低聚麥芽糖的水解而且可以催化它的轉(zhuǎn)移反應(yīng)[5]。之前的研究發(fā)現(xiàn)β-淀粉酶在水解4h后得到的SDS含量1.83%，為了得到更大的SDS含量，繼續(xù)利用轉(zhuǎn)苷酶對(duì)該樣品進(jìn)行處理，通過(guò)對(duì)處理后樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)與消化性能進(jìn)行分析探討，證明淀粉微觀結(jié)構(gòu)影響淀粉的消化性能，為酶法修飾重組慢消化淀粉提供充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

普通玉米淀粉 直鏈淀粉含量為24.6%，河北燕南食品集團(tuán)有限公司；豬胰α-淀粉酶（A3176） 美國(guó)Sigma公司；大麥β-淀粉酶、轉(zhuǎn)苷酶L-500 無(wú)錫杰能科生物工程有限公司；異淀粉酶、葡萄糖試劑盒（GOD-POD） 愛(ài)爾蘭Megazyme公司；纖維素酯微孔膜 0.45μm，海寧市正方過(guò)濾設(shè)備器材廠；乙酸鈉、碘化鉀、碘、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙酸等 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

恒溫振蕩水浴鍋 太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司；5804 R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Delta 320臺(tái)式pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司；ICS-5000離子色譜儀 美國(guó)戴安公司；UNICO UV-2012PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉的β-淀粉酶處理 稱(chēng)取8g淀粉，加入92mL去離子水，在95℃水浴下充分振蕩20min，冷卻至室溫，再加入0.5mol/L乙酸鈉緩沖液（pH5.2）至180mL，加入5.12μL β-淀粉酶，于55℃水浴中振蕩4h后，沸水浴5min滅酶，取18mL反應(yīng)液，剩余樣品冷卻后加入2倍體積的無(wú)水乙醇，靜置，于3000r/min離心10min，將沉淀冷凍干燥，得到淀粉樣品簡(jiǎn)稱(chēng)為BS。

1.2.2 淀粉的轉(zhuǎn)苷酶處理 向1.2.1中取出的18mL滅酶過(guò)的反應(yīng)液中，加入20mL 0.1mol/L乙酸鈉緩沖液（pH4.5），混勻后于95℃水浴振蕩20min，冷卻至室溫后，然后加入0.8mL轉(zhuǎn)苷酶（1U/mL），置于50℃恒溫水浴中振蕩反應(yīng)12h，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，靜置，于3000r/min離心10min，將沉淀冷凍干燥。

分別重復(fù)1.2.1過(guò)程取18mL滅酶過(guò)反應(yīng)液，再依照上述相同條件用轉(zhuǎn)苷酶另處理24、36h，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，靜置，于3000r/min離心10min，將沉淀冷凍干燥。

總共得到三種淀粉樣品分別簡(jiǎn)稱(chēng)為BT1、BT2、BT3。

1.2.3 用Englyst法測(cè)定消化性能 取3g豬胰α-淀粉酶加入10mL 0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液（pH5.2），在燒杯中溶解后4℃離心，取上清液加入1mL糖化酶，混酶配制完成。

稱(chēng)取淀粉樣品300mg，加入三角瓶中，添加7.5mL pH5.2的0.5mol/L乙酸鈉緩沖液，混勻后在95℃水浴振蕩處理20min，冷卻至室溫后再置于37℃恒溫水浴中，待溫度平衡后加入0.75mL混酶液，開(kāi)始振蕩反應(yīng)（轉(zhuǎn)速為150r/min）并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)。水解20、120min后，分別取出0.5mL水解液加入20mL 66%乙醇滅酶[3]，靜置，離心，然后離心處理后的上清液用葡萄糖試劑盒中的葡萄糖氧化酶（GOPOD）法在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定產(chǎn)生的葡萄糖含量。具體計(jì)算公式如下：

式中：m20為淀粉酶水解20min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量，mg；mFG為酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖質(zhì)量，mg；m120為淀粉酶水解120min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量，mg；mTS為樣品中總淀粉質(zhì)量，mg；RDS為慢消化淀粉；SDS為快消化淀粉；RS為抗性淀粉。

1.2.4 淀粉樣品的碘吸附及波長(zhǎng)掃描 稱(chēng)取2g碘化鉀，溶解至100mL pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，然后加入0.2g碘，溶解后低溫避光保存。

取0.08g淀粉樣品，加入到20mL二甲亞砜中，加熱使樣品充分溶解，從中取1mL樣品溶液至100mL去離子水中，混勻后取出0.8mL，再加入20μL碘液，充分混勻后立即倒入比色皿內(nèi)，在可見(jiàn)光500～800nm的范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，得到掃描圖形和數(shù)據(jù)。

1.2.5 淀粉樣品的鏈長(zhǎng)分布 參照繆銘[6]等對(duì)淀粉的預(yù)處理方法，稱(chēng)取淀粉樣品10mg，加入0.9mL蒸餾水，充分振蕩，95℃水浴加熱15min，然后冷卻至室溫，再加入2.5mL 0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液（pH4.0），放置于40℃水浴鍋中，待溫度平衡后，加入5μL異淀粉酶（1000U/mL），于40℃保溫振蕩24h后，立即取出脫支處理后的樣品并沸水浴滅酶。

將得到的樣品在10000r/min離心10min，取上清液并稀釋?zhuān)缓笥?.45μm的纖維素酯微孔膜過(guò)濾，得到的濾液進(jìn)行離子色譜分析，參照CHANG等人[7]的高效陰離子交換色譜（High performance anion exchange chromatography，HPAEC）分析方法，使用CarboPac PA 200色譜柱分離脫支樣品。先用250mmol/L氫氧化鈉溶液平衡色譜柱，然后用1mol/L乙酸鈉溶液和100mmol/L氫氧化鈉溶液以0.5mL/min的流速做樣品洗脫液。分析后得到不同聚合度的峰型圖。

1.2.6 計(jì)算鏈長(zhǎng)分布比例和分支密度 根據(jù)HPAEC結(jié)果得到的各個(gè)DP值峰面積，計(jì)算出各鏈長(zhǎng)分布的比例、平均鏈長(zhǎng)和淀粉的分支密度[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 淀粉樣品的消化性能

從表1可以看出，β-淀粉酶和轉(zhuǎn)苷酶的處理使得淀粉樣品的RDS含量得到降低，說(shuō)明SDS含量和RS總含量有所提高，得到樣品的消化性能有所改善。糊化淀粉的SDS含量?jī)H為0.35%，經(jīng)過(guò)β-淀粉酶水解處理后的BS樣品SDS含量達(dá)到了1.83%，再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)苷酶處理12、24、36h后的BT1、BT2、BT3樣品整體SDS含量都有了更明顯地提高，這一結(jié)論與Ao等人[4]用β-淀粉酶和轉(zhuǎn)苷酶處理玉米淀粉后的SDS含量增加的結(jié)果相符，說(shuō)明雙酶處理有助于有效改善淀粉消化性質(zhì)。而且轉(zhuǎn)苷酶酶處理時(shí)間長(zhǎng)短也影響著淀粉SDS含量，其中BT2樣品得到了13.95%的SDS含量，BT3樣品的SDS含量為13.5%，略低于BT2，足夠的轉(zhuǎn)苷作用可以達(dá)到提高SDS的目的，然而當(dāng)轉(zhuǎn)苷時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)有小幅度的下降。另外，BT1、BT2、BT3樣品在轉(zhuǎn)苷作用后，RS含量反而下降。

表1 β-淀粉酶、轉(zhuǎn)苷酶處理的淀粉樣品消化性能Table 1 Digestibility of starch treated by β-amylase and transglucosidase

由于淀粉的分支密度和結(jié)晶結(jié)構(gòu)是形成SDS的重要因素，通過(guò)部分縮短支鏈淀粉外鏈和直鏈淀粉的長(zhǎng)度形成高密度的分支鏈，增加淀粉的分支密度能改變其慢消化性能[9]。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，BS樣品再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)苷酶的糖苷轉(zhuǎn)移作用，結(jié)構(gòu)又有了新的變化，轉(zhuǎn)苷酶的轉(zhuǎn)苷作用使淀粉產(chǎn)生了更多的分支糖苷鍵，形成了類(lèi)似于簇狀的分支結(jié)構(gòu)，減緩了消化速率。

2.2 淀粉-碘吸附結(jié)合物

碘液與淀粉顯色原理是碘分子可以鉆入支鏈淀粉螺旋空隙當(dāng)中，并借助范德華力與直鏈淀粉聯(lián)系在一起，從而形成絡(luò)合物。這種絡(luò)合物能比較均勻地吸收除藍(lán)光以外的其他可見(jiàn)光，從而使淀粉變?yōu)樯钏{(lán)色，并且最大峰出現(xiàn)的波長(zhǎng)越小，淀粉的鏈越短，所以淀粉-碘吸附曲線可以在一定程度上反映出淀粉的內(nèi)部鏈結(jié)構(gòu)。

從圖1可以看出，其中未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)苷酶處理的BS樣品在4個(gè)樣品中吸光度值最高。顯然，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)苷酶處理后的吸光度值下降了很多，而且最大吸收波長(zhǎng)向低值偏移。BT1、BT2、BT3樣品的三條波段吸收曲線變化趨勢(shì)是基本一致的，都在550～575nm出現(xiàn)了最大吸收峰，但三者的吸光度值和最大吸收波長(zhǎng)都略有不同：BT1、BT2、BT3的吸光度值依次下降，即轉(zhuǎn)苷酶處理時(shí)間越長(zhǎng)，吸光度值越??；但最大吸收峰的波長(zhǎng)偏移則不同，BT2樣品最大吸收波長(zhǎng)最小，BT1樣品最大吸收波長(zhǎng)最大，BT3則居中。

圖1 淀粉-碘吸附結(jié)合物的可見(jiàn)光吸收曲線Fig.1 Wavelength scanning profiles of starch samples binding iodine

圖1表明轉(zhuǎn)苷酶的處理時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)影響淀粉碘吸附能力的大小。轉(zhuǎn)苷酶對(duì)BS樣品的作用中發(fā)生了結(jié)構(gòu)的改變，轉(zhuǎn)苷作用從長(zhǎng)分支鏈切下葡聚糖，然后轉(zhuǎn)移形成更多的分支，所以平均鏈長(zhǎng)變短。Xinyu[10]對(duì)β-淀粉酶水解的淀粉進(jìn)行碘吸附，得出淀粉鏈長(zhǎng)的縮短會(huì)減弱碘分子的吸附能力的結(jié)論，解釋了BT1、BT2、BT3樣品在圖1中表現(xiàn)出比BS樣品小很多的吸光度值，而且最大吸收峰明顯的往短波長(zhǎng)方向偏移，不同處理的時(shí)間導(dǎo)致了不同程度的偏移，而這種偏移程度與各自SDS含量的變化是一致的。

2.3 淀粉樣品的分支鏈長(zhǎng)分布

圖2 BS、BT1、BT2、BT3分別經(jīng)過(guò)HPAEC得到的色譜圖Fig.2 Chromatograms of BS，BT1，BT2，BT3after HPAEC

表2 淀粉樣品的不同鏈長(zhǎng)部分的面積Table 2 Chain length distribution of starch samples

HPAEC分析得到淀粉分支鏈長(zhǎng)分布，通過(guò)其中各個(gè)峰的大小可以看出不同聚合度（DP）的鏈長(zhǎng)所占的比例。從表2中的各樣品鏈長(zhǎng)分布的變化可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間轉(zhuǎn)苷酶處理淀粉的長(zhǎng)鏈與短鏈分配的比率存在明顯的差異，在BS淀粉樣品中含有較多中短鏈（FrⅡ+FrⅢ），轉(zhuǎn)苷酶處理過(guò)后的淀粉含有的大部分是短鏈（FrⅢ）。通常將淀粉分支側(cè)鏈分為A、B、C三種鏈，鏈的末端都具有一個(gè)非還原末端。其中，A鏈?zhǔn)峭怄湥?jīng)由α-1，6糖苷鍵與B鏈連接，B鏈又經(jīng)由α-1，6糖苷鍵與C鏈連接，A鏈與B鏈的數(shù)目大體相等，C鏈?zhǔn)侵麈湥總€(gè)支鏈淀粉只有1個(gè)C鏈。B鏈依據(jù)側(cè)鏈各自的長(zhǎng)度和跨越的簇的數(shù)量，可進(jìn)一步被分為B1、B2、B3等鏈。一般來(lái)說(shuō)，A鏈的聚合度（DP）小于13（最短鏈），B1鏈的DP為13～30，B2鏈的DP為31～50，而B(niǎo)3則更長(zhǎng)些[11-12]。因此可以推斷出所有樣品都含有高比例的A鏈，其次是B1鏈，B2、B3鏈含量都很低，除此之外，轉(zhuǎn)苷酶處理時(shí)間越長(zhǎng)，短鏈（FrⅢ）增加的越多，中長(zhǎng)鏈（FrⅠ+FrⅡ）則相應(yīng)的減少。

2.4 淀粉樣品的平均鏈長(zhǎng)和分支密度

表3 淀粉樣品的平均鏈長(zhǎng)和分支密度Table 3 Average chain length and branch density of starch samples

由表3可以看出，BT3樣品即轉(zhuǎn)苷酶處理36h得到樣品的平均鏈長(zhǎng)為11.23，在所有樣品中為最小，而B(niǎo)S樣品的平均鏈長(zhǎng)最大。由此發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)苷酶處理后的樣品，鏈長(zhǎng)在不斷下降，而且酶處理時(shí)間越久，相對(duì)應(yīng)的樣品平均鏈長(zhǎng)越小。另外，相比于BS樣品，BT1、BT2、BT3三個(gè)樣品的分支密度都有提高，且隨轉(zhuǎn)苷酶處理時(shí)間越長(zhǎng)分支密度則越高。以上結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)苷酶的處理有效改變了淀粉分子的內(nèi)部鏈結(jié)構(gòu)。

將表3的平均鏈長(zhǎng)和分支密度同表1中各樣品的SDS含量對(duì)照，發(fā)現(xiàn)樣品中分支密度最高的BT3樣品，平均鏈長(zhǎng)最短為11.23，但其相對(duì)應(yīng)SDS含量為13.50%，略低于BT2樣品中13.95%的慢消化淀粉含量。由此可說(shuō)明，樣品的分支密度越大，相對(duì)應(yīng)SDS含量不一定越高，它們之間不是呈正比關(guān)系，分支密度過(guò)高和過(guò)低都有可能會(huì)出現(xiàn)SDS含量下降，只有將樣品的分支密度提高，平均鏈長(zhǎng)下降至一定程度，才能得到最大的SDS含量，這與Zhang[13]等報(bào)道分支外鏈在一定DP值范圍內(nèi)的SDS含量最高的結(jié)論相一致。

綜上所述，由表1和表3可以充分驗(yàn)證，SDS含量的變化確實(shí)和淀粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系，更準(zhǔn)確地說(shuō)是淀粉鏈結(jié)構(gòu)的平均長(zhǎng)度和分支密度影響了SDS含量，而且正是酶對(duì)淀粉的處理才使得淀粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。當(dāng)酶的催化糖苷轉(zhuǎn)移作用充分改變了淀粉鏈長(zhǎng)，平均鏈長(zhǎng)變短，分支度增加后，淀粉酶、糖化酶在消化淀粉的時(shí)候，受到多分支結(jié)構(gòu)的阻力，減緩了消化速度。如果轉(zhuǎn)苷作用導(dǎo)致淀粉鏈長(zhǎng)過(guò)短，消化酶很容易接觸到分支鍵，淀粉會(huì)被快速消化成還原糖。

3 結(jié)論

雙酶處理對(duì)淀粉分子的鏈結(jié)構(gòu)以及其消化性質(zhì)產(chǎn)生的影響表明，短鏈不利于結(jié)合更多的碘分子，并且可見(jiàn)光吸收的最大吸收波長(zhǎng)與淀粉樣品SDS含量存在關(guān)系；分支密度影響著SDS含量的高低，有效提高SDS含量的方法就是形成多分支短鏈的簇型結(jié)構(gòu)。所以本實(shí)驗(yàn)證明，酶法修飾淀粉可以達(dá)到重組淀粉結(jié)構(gòu)，從而改善淀粉消化性能的目的，在食品工業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊前景。

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Effect of dual-enzymes treatment on chain structure and digestibility of maize starch

XIONG Shan-shan1，2，MIAO Ming1，JIANG Bo1，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS231

A

1002-0306（2012）16-0127-04

2012-01-16 *通訊聯(lián)系人

熊珊珊（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品加工新技術(shù)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20976073，31000764）；江蘇省科技支撐項(xiàng)目（BE2010717）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金（JUSRP10930）。