劉雅莉，劉 芳，劉 箐，韓舜愈，孫志博，夏俊芳，朱小清

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅蘭州730030;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070;3.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093;4.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，甘肅蘭州730020;5.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000;6.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局，甘肅蘭州730020)

兩種酶標(biāo)抗體制備方法的比較及李斯特菌TAS ELISA試劑盒性能的優(yōu)化

劉雅莉1，2，3，劉 芳4，劉 箐3，*，韓舜愈2，孫志博5，夏俊芳2，朱小清6

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅蘭州730030;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070;3.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093;4.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，甘肅蘭州730020;5.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000;6.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局，甘肅蘭州730020)

研制一種低成本、快速、準(zhǔn)確的三抗體夾心酶聯(lián)免疫(Three antibodies sandwich ELISA，TAS-ELISA)檢測(cè)試劑盒。采用戊二醛法、改良過(guò)碘酸鈉法分別制備堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)、辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG，比較單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)TAS-ELISA試劑盒兩種酶標(biāo)抗體的檢測(cè)效果，并考察了試劑盒的檢測(cè)靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、保存周期等指標(biāo)。結(jié)果表明，采用改良過(guò)碘酸鈉法制備的HRP-IgG效果好，克分子比最高可達(dá)2.9，酶結(jié)合率達(dá)27%;試劑盒檢測(cè)周期6h，檢測(cè)成本為3.5元/孔，特異性實(shí)驗(yàn)、干擾實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明采用該方法制備的酶標(biāo)抗體，特異性好、結(jié)果穩(wěn)定可靠。自制TAS-ELISA試劑盒檢測(cè)性能可達(dá)到商業(yè)化試劑盒水平，為該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化提供了一定的理論依據(jù)。

單核細(xì)胞增生性李斯特菌，改良過(guò)碘酸鈉法，堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，三抗體夾心ELISA

Abstract:To develop a low-cost，rapid and accurate TAS-ELISA KIT.This study preparated AP-IgG and HRP-IgG by glutaraldehyde method and improved periodate method respectively and compared two enzyme conjugates of Listeria monocytogenes TAS-ELISA KIT，further investigated some indexes including the sensitivity，specificity，stability，shelf life.The results showed that HRP-IgG preparated with improved periodate method was more effective，the molar ratios was 2.9，the rate of enzyme-labeled was 27%.The detection time of KIT was 6h，the detection cost was ￥3.5/well.Specific experiment，interference experiment，repetitive experiment and stable experiment indicated that the HRP-IgG preparated with improved periodate method was specific and reliable.The performance of self-made TAS-ELISA KIT could reach commercial KIT，it also could provide theoretical basis for industrialization of the product.

Key words:Listeria monocytogenes;improved periodate method;AP;HRP;TAS-ELISA

單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是WHO公認(rèn)的四大食源性致病菌之一，已被許多國(guó)家列為食品安全零檢出項(xiàng)目。目前針對(duì)LM的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)、膠體金試紙條、ELISA、PCR、免疫捕捉 PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR、免疫磁珠PCR、PCR-變性高效液相色譜、PCR-核酸層析、基因芯片、電子鼻、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增［1-10］等，這些檢測(cè)手段或操作繁瑣、或特異性不強(qiáng)、或成本過(guò)高，嚴(yán)重影響了檢測(cè)質(zhì)量，降低了檢測(cè)效率，延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間，增加了檢測(cè)成本;ELISA方法是實(shí)驗(yàn)室最為常用的檢測(cè)手段，但是目前針對(duì)食源性致病菌的ELISA全套試劑盒需從國(guó)外公司購(gòu)買，檢測(cè)成本高，嚴(yán)重制約了ELISA試劑盒在我國(guó)食品安全檢測(cè)中的普及;因此，本研究旨在建立一種成本低廉、穩(wěn)定性好、適于國(guó)內(nèi)試劑盒產(chǎn)業(yè)化的酶標(biāo)抗體的方法。ELISA分為間接 ELISA(Indirect ELISA)、競(jìng)爭(zhēng)ELISA(Competitive ELISA)、雙抗體夾心ELISA(DoubleantibodiessandwichELISA，DASELISA)、三抗體夾心ELISA(Three antibodies sandwich ELISA，TAS-ELISA)，其中以 DAS-ELISA和 TASELISA最為常用。與DAS-ELISA相比，TAS-ELISA具有以下優(yōu)點(diǎn):a.TSA-ELISA進(jìn)行酶標(biāo)記的抗體是通用的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，它可以結(jié)合所有兔源或鼠源的抗體，這樣只需一株酶標(biāo)羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，即可滿足所有相關(guān)試劑盒檢測(cè)抗體需求，大大降低了實(shí)驗(yàn)成本;DAS-ELISA需要對(duì)第二株抗體進(jìn)行酶標(biāo)記，由于不同抗體的特殊性，無(wú)法保證酶標(biāo)抗體的質(zhì)量和穩(wěn)定性，若購(gòu)買進(jìn)口酶標(biāo)檢測(cè)抗體，則大大增加了檢測(cè)成本;b.TSA-ELISA在DASELISA雙抗體夾心的基礎(chǔ)上，采用第三株酶標(biāo)抗體進(jìn)行酶促反應(yīng)，特異性比DAS-ELISA好，可以減少假陽(yáng)性、假陰性的出現(xiàn)。本研究采用戊二醛法、改良過(guò)碘酸鈉法分別制備堿性磷酸(Alkaline Phosphatase，AP)、辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG，并比較了兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，建立了一種適用于食品中LM的TAS-ELISA檢測(cè)試劑盒的抗體酶標(biāo)技術(shù)，為該試劑盒在我國(guó)的產(chǎn)業(yè)化提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

堿性磷酸酶(500U) 寶生物工程(大連)有限公司;辣根過(guò)氧化物酶(RZ＞3.0) 蘭州鵬程生物;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 碧云天公司;過(guò)碘酸鈉Sigma公司;LM單克隆抗體(ab11439)、多克隆抗體(ab20506) Abcam公司;山羊抗兔 IgG抗體(SA27) Solarbio公司;HRP-羊抗兔抗體 中杉金橋。

全自動(dòng)酶標(biāo)儀MK3 芬蘭雷勃公司;高速離心機(jī)3K30 Sigma公司;磁力攪拌器RCT基本型 IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 梯度菌液、模擬帶菌菌液、底物溶液的制備LM標(biāo)準(zhǔn)菌株用腦心浸液肉湯培養(yǎng)后稀釋101～108倍，并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)(各梯度純菌懸液分別設(shè)3個(gè)重復(fù))，梯度菌液計(jì)數(shù)結(jié)果為 1.37×109～1.37×101cfu/mL。

選取易受LM污染的6種食品(牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香腸、生豬肉)各25g碾碎并與250mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液混合，以此為稀釋液梯度稀釋LM純菌液，制備梯度模擬菌液。

HRP顯色底物溶液(四甲基聯(lián)苯胺，TMB)的配制。A液:3mg/mL TMB(30mgTMB粉末、10mL二甲基亞砜);B液:檸檬酸溶液(檸檬酸 4.41g、Na2HPO4·12H2O 20.77g、無(wú)菌水 500mL、pH5.5)。使用前將A液1mL、B液19mL混合并加入14μL雙氧水混勻備用。

1.2.2 山羊抗兔IgG抗體濃度的測(cè)定 用生理鹽水將山羊抗兔IgG抗體稀釋不同倍數(shù)(100、500、1000倍)，同時(shí)用生理鹽水作陰性對(duì)照，采用BCA試劑盒測(cè)定抗體濃度，操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)(編號(hào)P0012)。

1.2.3 戊二醛法制備AP-羊抗兔IgG 280μL PBS中加入 20μL AP、2.4μL戊二醛混勻后室溫靜置3～5h;取混合液裝入透析袋 PBS中 4℃冰箱透析18h;次日將透析袋中液體小心吸出，并加入山羊抗兔IgG，混勻后室溫靜止5h;再次PBS 4℃冰箱透析18h，吸出酶標(biāo)抗體備用。

1.2.4 改良過(guò)碘酸鈉法［11］制備HRP-羊抗兔IgG取5mg HRP溶于2mL無(wú)菌水中，并加入NaIO4若干，0℃放置若干分鐘;混合液于醋酸鈉緩沖液中4℃透析12～24h;小心吸出混合液，加入乙二醇若干，0℃封閉1h;混合液加入山羊抗兔IgG若干，于CB緩沖液中4℃透析12～24h;結(jié)合物加入 NaBH4若干量，4℃還原3h;加入等體積飽和硫酸銨，4℃鹽析24h;次日取出混合物6000r/min離心20min，棄上清，沉淀用0.5mL生理鹽水溶解備用;若需長(zhǎng)期保存可加入等體積甘油，-20℃保存?zhèn)溆?。整個(gè)操作步驟注意避光。

1.2.5 改良過(guò)碘酸鈉法的優(yōu)化 乙二醇還原步驟的優(yōu)化:NaIO4氧化后加入乙二醇，再用醋酸鈉緩沖液透析;NaIO4氧化并醋酸鈉緩沖液透析后，乙二醇還原。

NaIO4氧化濃度的優(yōu)化:5mg HRP中分別加入21mg/mL 的 NaIO40.2、0.3、0.4、0.5mL。

NaIO4氧化時(shí)間的優(yōu)化:0℃冰浴搖動(dòng)15、30、45、60min。

乙二醇還原量的優(yōu)化:5mg HRP分別需要0.16mol/L 乙二醇 0.3、0.5、0.7、0.9mL。

酶、抗體最佳結(jié)合比例的優(yōu)化:酶∶抗體質(zhì)量比分別為 2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。

NaBH4封閉量的優(yōu)化:5mg HRP中分別加入5mg/mL NaBH40.1、0.3、0.4、0.5mL。

1.2.6 酶標(biāo)抗體(HRP-山羊抗兔IgG)質(zhì)量的鑒定按照以下公式計(jì)算酶量、IgG量、克分子比、酶結(jié)合率(僅針對(duì)改良過(guò)碘酸鈉法制備的酶標(biāo)抗體)。

酶量(mg/mL)=OD403×0.4;IgG量(mg/mL)=克分子比=酶量×4/IgG量;酶結(jié)合率(%)=酶量/5mg×100(OD403是酶中鐵葉琳輔基的吸光度，OD280是抗體-酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度)。

1.2.7 試劑盒封閉液的優(yōu)化 TAS-ELISA檢測(cè)中的封閉步驟至關(guān)重要，如果封閉不好很可能導(dǎo)致本底過(guò)高。本研究采用6種不同的封閉液進(jìn)行封閉實(shí)驗(yàn)(5%BSA、10%BSA、5%BSA+5% 蔗糖、10%BSA+5%蔗糖、3%明膠、5%明膠)，以期達(dá)到最優(yōu)的封閉效果。

表1 兩種自制酶標(biāo)抗體不同稀釋度檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 The comparison on two kinds of self-enzyme conjugates from different dilutions

1.2.8 試劑盒靈敏度測(cè)定 LM單克隆抗體包被酶聯(lián)板(1μg/mL)4℃過(guò)夜;PBST洗滌后封閉液37℃封閉1h;PBST洗滌;加入樣品，37℃ 2h;洗滌后加入LM多克隆抗體(1μg/mL)37℃ 1.5h;洗滌并加入自制酶標(biāo)抗體，37℃1.5h;PBST洗滌，TMB顯色 5～10min(AP底物為PNP)，2mol/L濃硫酸終止反應(yīng)，測(cè)OD450(AP測(cè)OD405)，判斷原則:陰性對(duì)照OD＜0.1且陽(yáng)性對(duì)照OD/陰性對(duì)照OD＞2.0表明實(shí)驗(yàn)成功、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠;樣品OD/陰性O(shè)D﹥2.0為陽(yáng)性、樣品OD/陰性O(shè)D﹤2.0為陰性。

1.2.9 試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)、干擾實(shí)驗(yàn) 特異性實(shí)驗(yàn):TAS-ELISA試劑盒檢測(cè)LM等20株致病菌，來(lái)驗(yàn)證試劑盒檢測(cè)LM的特異性，觀察是否有交叉反應(yīng)、是否有假陽(yáng)性出現(xiàn)。

干擾實(shí)驗(yàn):將LM與其他致病菌1∶1等量混合后取100μL為樣品加入酶聯(lián)孔中，觀察其它致病菌是否對(duì)TAS-ELISA檢測(cè)LM有非特異性干擾、是否有假陰性出現(xiàn)。

1.2.10 試劑盒重復(fù)性和穩(wěn)定性測(cè)定 試劑盒板內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):在同一包被板上，以109cfu/mL的純菌液、牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香腸、生豬肉為樣品(每個(gè)樣品5個(gè)反應(yīng)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照)，利用自制的TAS-ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算每個(gè)樣品OD450的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)而計(jì)算每個(gè)樣品的板內(nèi)變異系數(shù)(以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次)。

試劑盒板間重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取5個(gè)包被板，以109cfu/mL的純菌液、牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香腸、生豬肉為樣品(每個(gè)樣品在每個(gè)包被板上設(shè)置1個(gè)反應(yīng)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照)，進(jìn)行TAS-ELISA檢測(cè)，計(jì)算每個(gè)樣品OD450的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)而計(jì)算每個(gè)樣品的板間變異系數(shù)(以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次)。

1.2.11 試劑盒保存期實(shí)驗(yàn) 將制備好的酶標(biāo)抗體、底物溶液、試劑盒(包括已包被抗體的酶聯(lián)板、各種緩沖液、抗體、底物溶液)置于4℃冰箱保存，并于0、30、60、90d對(duì)其進(jìn)行 TAS-ELISA檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 山羊抗兔IgG濃度的測(cè)定

BCA濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)結(jié)果:山羊抗兔IgG平均濃度為104.58mg/mL(圖1)。

2.2 兩種自制酶標(biāo)抗體檢測(cè)結(jié)果

圖1 山羊抗兔IgG抗體濃度測(cè)定結(jié)果Fig.1 The concentration of goat anti-rabbit IgG

表1結(jié)果顯示:AP-山羊抗兔IgG僅在稀釋10倍時(shí)有微弱的顏色反應(yīng)，且成本較高(500U AP僅能制備酶標(biāo)抗體20μL);而自制HRP-山羊抗兔IgG在稀釋1500倍時(shí)仍有較強(qiáng)的顏色反應(yīng)，說(shuō)明HRP-山羊抗兔IgG效果優(yōu)于AP-山羊抗兔IgG。分析其原因主要如下:戊二醛法僅有2%～10%的酶與40%的抗體蛋白結(jié)合，而且結(jié)合物有效部分只占5%，酶和抗體的利用率低;過(guò)碘酸鈉改良法在低pH條件下直接氧化HRP，可以使70%～90%的酶與99%的抗體蛋白結(jié)合，交聯(lián)效果好、酶失活小，且酶活性不受影響。有文獻(xiàn)表明HRP可提高檢測(cè)靈敏度［12-13］，且改良法HRP自身交聯(lián)率僅為5%，標(biāo)記效果優(yōu)于戊二醛法、經(jīng)典過(guò)碘酸鈉氧化法、戊二醛-過(guò)碘酸鈉氧化法［11，14］。

2.3 改良過(guò)碘酸鈉法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)酶標(biāo)抗體質(zhì)量的鑒定

改良過(guò)碘酸鈉法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表2)，氧化5mg HRP用0.2mL 21mg/mL NaIO4效果最好，此時(shí)酶溶液會(huì)立即呈現(xiàn)灰綠色，這是由于酶分子中含有鐵葉啉，故氧化過(guò)程中顏色的改變也是證明HRP有無(wú)徹底氧化的最佳證據(jù)。NaIO4氧化時(shí)間在15min已能滿足要求，時(shí)間過(guò)短則不能徹底氧化，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)降低酶活力，導(dǎo)致結(jié)合物效價(jià)降低。有些文獻(xiàn)在HRP的標(biāo)記過(guò)程中沒(méi)有乙二醇還原的步驟，本實(shí)驗(yàn)證明加入乙二醇是極其必要的，因?yàn)镹aIO4可以在很短的時(shí)間內(nèi)將乙二醇氧化成乙二醛，這樣可以阻止NaIO4對(duì)酶的繼續(xù)氧化，有效避免了氧化過(guò)度造成的酶活力下降。加入乙二醇后原來(lái)的灰綠色溶液逐漸恢復(fù)了原來(lái)的橙色，實(shí)驗(yàn)證明0.3mL 0.16mol/L乙二醇已經(jīng)足以阻止氧化劑對(duì)酶的過(guò)度氧化。酶與抗體結(jié)合的質(zhì)量比是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟，實(shí)驗(yàn)表明“酶∶抗體質(zhì)量比=1∶2”時(shí)能夠達(dá)到最大的結(jié)合效率，2∶1、1∶1、1∶3 時(shí)效果都不好，這與其他研究者的結(jié)果一致［15］;用飽和硫酸銨沉淀時(shí)，酶結(jié)合物(橙色)在沉淀部分，“酶∶抗體質(zhì)量比=2∶1”實(shí)驗(yàn)組上清出現(xiàn)橙色，說(shuō)明酶過(guò)量，即上清中存在未結(jié)合的酶;1∶1、1∶2、1∶3實(shí)驗(yàn)組上清接近無(wú)色，表明酶與抗體幾乎完全結(jié)合;少量未結(jié)合的酶可以通過(guò)離心或洗滌的方法除去，不會(huì)影響最終的顯色;但是如果抗體量過(guò)多，那么未標(biāo)記的抗體會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原，減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量，所以絕不能使抗體的量遠(yuǎn)大于酶的量。5mg HRP中加入5mg/mL NaBH40.1mL，此時(shí)未見(jiàn)明顯氣泡產(chǎn)生;而加入0.3、0.4、0.5mL時(shí)，管壁產(chǎn)生大量氣泡。資料顯示，酶標(biāo)抗體克分子比為0.7則標(biāo)記效果一般，為1.0效果較好，大于1.5效果滿意;酶結(jié)合率7%效果一般，9%～10%效果較好，高于25%為滿意。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果制備的酶標(biāo)抗體克分子比最高可達(dá)2.9，酶結(jié)合率達(dá)27%，標(biāo)記效果較為滿意。

表2 酶標(biāo)記抗體(HRP-山羊抗兔IgG)質(zhì)量的鑒定Table 2 The identification of HRP-IgG

表3 自制酶標(biāo)抗體、商業(yè)化酶標(biāo)抗體TAS-ELISA試劑盒檢測(cè)靈敏度Table 3 The sensitivity of self-made enzyme conjugates and commercial enzyme conjugates

2.4 試劑盒最優(yōu)封閉液的確定

圖2中10%BSA、10%BSA+10%蔗糖、3%明膠、5%明膠封閉效果不好，可能是封閉不當(dāng)造成的陰性本底過(guò)高;與“5%BSA”相比，“5%BSA+10%蔗糖”效果更好，這可能是由于蔗糖起到了固化劑的作用，使BSA封閉效果更佳。

2.5 試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3結(jié)果顯示:自制酶標(biāo)抗體、商業(yè)化酶標(biāo)抗體TAS-ELISA試劑盒在純菌液、果汁、酸奶、雪糕、香腸、生豬肉中的檢測(cè)靈敏度一致，依次是106、107、107、106、108、109cfu/mL;在牛奶中兩種方法的檢測(cè)靈敏度分別為 107、109cfu/mL。

2.6 試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)、干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

自制TAS-ELISA試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表4):LM的檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，其他18株致病OD450均低于0.1，無(wú)假陽(yáng)性出現(xiàn)，表明該方法檢測(cè)LM特異性好。干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:金黃色葡萄球菌等18株常見(jiàn)致病菌對(duì)該法沒(méi)有干擾，即使有一半其他雜菌的存在，該方法也可特異性檢出LM，不會(huì)有假陰性的出現(xiàn)。

表4 自制TAS-ELISA試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)、干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The result of specific experiment and interference experiment by Self-TAS-ELISA KIT

表5 試劑盒板內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The repeatable result in the same 96-well plate

圖2 6種不同封閉液的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The test result of six different blocking solution

2.7 試劑盒的重復(fù)性、穩(wěn)定性

表5、表6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明:自制酶標(biāo)抗體TASELISA試劑盒板內(nèi)變異系數(shù)在0.89%～2.99%之間，板間變異系數(shù)在0.93%～4.74%之間。一般ELISA要求板內(nèi)變異系數(shù)低于5%、板間變異系數(shù)低于10%［16］，本試劑盒均符合以上要求，說(shuō)明該試劑盒重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高。

HRP常用的底物有鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、2，2＇-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)等。本研究采用TMB作底物的主要原因是:TMB經(jīng)酶作用后由無(wú)色變藍(lán)色，目測(cè)對(duì)比鮮明，加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計(jì)中定量，無(wú)致癌作用;且張喜悅等［17］的研究證明，TMB較OPD、TMB、ABTS而言，更適合做 ELISA實(shí)驗(yàn)的底物。

2.8 試劑盒的保存期

圖3顯示:自制酶標(biāo)抗體、TMB底物溶液、試劑盒0～90d檢測(cè)結(jié)果OD值基本保持一致、無(wú)顯著差異，表明其在4℃冰箱至少可以保存90d，說(shuō)明該試劑盒具有較好的穩(wěn)定性。

2.9 試劑盒的檢測(cè)成本、檢測(cè)周期

試劑盒成本:Abcam公司LM單克隆抗體(4000元、2500孔)成本1.6元/孔;Abcam公司LM單克隆抗體(4000元、4000孔)成本1.0元/孔;Solarbio公司山羊抗兔IgG抗體價(jià)格較低，小于0.5元/孔;因此自制TAS-ELISA試劑盒成本小于3.5元/孔。

檢測(cè)周期:檢測(cè)時(shí)直接在已經(jīng)包被LM單克隆抗體的酶聯(lián)板中加入樣品，孵育2h;封閉1h;洗滌后加入LM多克隆抗體，孵育1.5h;加入自制酶標(biāo)抗體，37℃1.5h;TMB顯色5～10min后濃硫酸終止反應(yīng)，整個(gè)檢測(cè)周期少于6h。

表6 試劑盒板間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The repeatable result in the different 96-well plate

圖3 試劑盒保存期實(shí)驗(yàn)Fig.3 The result of validity by Self-TAS-ELISA KIT

3 結(jié)論

TAS-ELISA是一種以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本研究制備的酶標(biāo)抗體克分子為2.9，酶結(jié)合率達(dá)27%，標(biāo)記效果滿意;自制酶標(biāo)抗體TAS-ELISA試劑盒檢測(cè)限與商業(yè)化酶標(biāo)抗體TAS-ELISA試劑盒相同，特異性實(shí)驗(yàn)、干擾實(shí)驗(yàn)表明常見(jiàn)食源性致病菌對(duì)該法沒(méi)有抑制和干擾，同時(shí)試劑盒具有較好的穩(wěn)定性(板內(nèi)變異系數(shù)最高為2.99%、板間變異系數(shù)最高為4.74%)，檢測(cè)成本為3.5元/孔，使用包被好抗體的酶聯(lián)板，檢測(cè)周期僅需6h。TAS-ELISA試劑盒不需提取DNA、不需增菌、可同時(shí)檢測(cè)大量樣品，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，是一種靈敏、特異、快速、高通量、低成本的檢測(cè)技術(shù)。另外，TAS-ELISA較DAS-ELISA成本低、特異性好，提高了實(shí)驗(yàn)的可靠性與準(zhǔn)確度，完全適合日常檢測(cè)，有較高的使用價(jià)值和應(yīng)用前景。

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Comparison of two methods in preparation of enzyme conjugates and optimization of Listeria monocytogenes TAS-ELISA KIT

LIU Ya-li1，2，3，LIU Fang4，LIU Qing3，*，HAN Shun-yu2，SUN Zhi-bo5，XIA Jun-fang2，ZHU Xiao-qing6
(1.The Second Affiliated Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China;2.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;3.School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China;4.Internation Travel Healthcare Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730020，China;5.School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China;6.Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730020，China)

TS207.3

A

1002-0306(2012)15-0301-07

2011-12-26 *通訊聯(lián)系人

劉雅莉(1984-)，女，碩士，研究方向:食源性致病菌的快速檢測(cè)。

質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(GSCIQ_2010IK220)。