朱葉，章群，李貴生，劉海林，馬奔，黃小彧，司從利

（暨南大學(xué) 水生生物研究所，廣東 廣州 510632）

中國(guó)近海角木葉鰈（Pleuronichthys cornutus）種群遺傳多樣性研究

朱葉，章群，李貴生，劉海林，馬奔，黃小彧，司從利

（暨南大學(xué) 水生生物研究所，廣東 廣州 510632）

測(cè)定了中國(guó)沿海角木葉鰈4個(gè)群體57個(gè)體的線粒體控制區(qū)序列，在長(zhǎng)度為549 bp的線粒體控制區(qū)序列中，檢測(cè)到3個(gè)插入/缺失位點(diǎn)，24個(gè)變異位點(diǎn)（包括11個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)），共出現(xiàn)了37個(gè)單倍型，其中9個(gè)為共享單倍型。角木葉鰈整體的單倍型多樣度（Hd）和核苷酸多態(tài)度（Pi）結(jié)果分別為0.979±0.008和0.00655±0.0037，呈現(xiàn)出高單倍型多樣度和低核苷酸多態(tài)度分布模式。中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，角木葉鰈種群的Fu's Fs為顯著負(fù)值，核苷酸不配對(duì)分析呈現(xiàn)單峰分布，表明角木葉鰈在歷史上經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張事件。群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳距離為0.0065，群體間遺傳分化指數(shù)都為負(fù)值（-0.0067～-0.0460）但不顯著（P>0.1），AMOVA分析顯示遺傳變異主要集中在群體內(nèi)個(gè)體間（102.15%），均表明我國(guó)近海角木葉鰈種群無(wú)明顯的分化，可以作為一個(gè)漁業(yè)管理單位加以保護(hù)和利用。

角木葉鰈；線粒體控制區(qū)；遺傳多樣性；群體遺傳分化；種群歷史動(dòng)態(tài)

Abstract：The length of 549 bp mtDNA control region sequences of 57 individuals from 4 Pleuronichthys cornutus populations in the coastal waters of China was determined.3 insert/deletion sites，24 variable sites（including 11 parsinomy-informative sites） and 37 haplotypes were detected，of which 9 haplotypes were shared among populations.The global haplotype diversity（Hd） and nucleotide diversity（Pi） were 0.979±0.008 and 0.0061±0.0037 respectively，indicating a high haplotype diversity（Hd） and a low nucleotide diversity（Pi）.The significant negative values of neutral test of Fu's Fs and the unimodal mismatch distribution revealed a historical population expansion.As the average genetic distances within 4 populations were 0.0065，and genetic differentiation index（Fst） were negative（-0.0067～-0.0460） but not significant（P>0.1），and the majority genetic variation（102.15%）occurred within populations（102.15%）in AMOVA analysis，suggesting that Pleuronichthys cornutus populations in the coastal waters of China were not significantly differentiated and might be protected as a single management unit.

Keywords：Pleuronichthys cornutus； genetic diversity； mitochondrial DNA control region； stock genetic differentiation；demographic history

研究魚類種群遺傳多樣性是評(píng)估種質(zhì)資源現(xiàn)狀，制定野生群體保護(hù)與恢復(fù)策略，實(shí)施養(yǎng)殖群體遺傳改良的重要前提（Ward，2000）。中國(guó)地處西北太平洋，有著豐富的漁業(yè)資源，近年來(lái)一些學(xué)者開(kāi)展了部分海洋魚類種群結(jié)構(gòu)和遺傳變異研究（韓志強(qiáng)等，2006；蒙子寧等，2003），但到目前為止，對(duì)中國(guó)鰈形目魚類的研究多停留在形態(tài)與地理分布、生長(zhǎng)發(fā)育等生物學(xué)方面，如圓斑星蝶（陳四清等，2002）、鈍吻黃蓋鰈（孟天湘等，1986）等，而對(duì)遺傳多樣性的研究報(bào)道不多。角木葉鰈（Pleuronichthys cornutus） 隸屬鰈形目（Pleuronectiformes）鰈亞目（Pleuronectoidei）鰈科（Pleuronectidae），僅分布于中國(guó)、日本和朝鮮沿海，是肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的海洋經(jīng)濟(jì)魚類（Nelson，2006）。歷史上我國(guó)角木葉鰈資源相當(dāng)豐富，是沿海漁民的重要漁獲對(duì)象，但近些年來(lái)因海水污染、富營(yíng)養(yǎng)化、過(guò)度捕撈及產(chǎn)卵場(chǎng)地的破壞，野生資源迅速衰退（程慶賢等，1991）。

線粒體為單一母性遺傳、幾乎沒(méi)有重組、進(jìn)化速率快，能夠檢測(cè)傳統(tǒng)漁業(yè)生物學(xué)方法無(wú)法反映的種群遺傳特征，其中控制區(qū)是線粒體中進(jìn)化速度最快的區(qū)域，能夠較好地反映種群的遺傳變異（Kocher et al，1997），為此本文分析了中國(guó)沿海4個(gè)角木葉鰈群體線粒體控制區(qū)序列的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)與種群歷史動(dòng)態(tài)，旨在為角木葉鰈資源的保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

角木葉鰈樣品采自遼寧丹東10尾（編號(hào)LDD1-10） 與東港4尾（編號(hào)LDG1-4），東港亦屬丹東市，相隔較近，下文將LDG和LDD統(tǒng)稱為遼寧群體；山東嶗山14尾（編號(hào)SDLSh1-14），簡(jiǎn)稱山東群體；浙江岱山13尾（編號(hào)ZJDSh1-13），簡(jiǎn)稱浙江群體；廣東饒平16尾（編號(hào)GDRP1-16），簡(jiǎn)稱廣東群體。樣品采集后用95%乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組總DNA提取及PCR擴(kuò)增測(cè)序

采用高鹽法提取角木葉鰈總基因組DNA（Millers et al，1988）。PCR擴(kuò)增的引物是根據(jù)Genebank中角木葉鰈的近緣類群的線粒體控制區(qū)序列設(shè)計(jì)的，正向引物為CrF：5’-gtagctcagtgttagagcgcca-3’，反向引物為CrR： 5’-agagaaccccttacccgctggag-3’。PCR反應(yīng)在Biometra UNOⅡ儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)總體積30.0 μL（22.4 μL蒸餾水，3.0 μL10×Buffer，1.2 μLdNTP，1.2 μLBSA，左、右引物各 0.3 μL，0.6 μLTaq 酶，1 μL 模板 DNA）。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃，退火30 s，72℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物送至北京六和華大基因有限公司切膠純化，并在ABI3730 DNA自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

序列由人工校正后，用MEGA5.0軟件比對(duì)，計(jì)算序列堿基組成、變異位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換/顛換值、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、群體內(nèi)與群體間遺傳距離，用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的置信度由 1000次自舉法檢驗(yàn)（Flesenste，1992）。使用Dnasp5.00計(jì)算單倍型數(shù)量、核苷酸多態(tài)性（Pi）、單倍型多樣性（Hd）、遺傳分化的系數(shù)（Fst）。用Arlequin 3.11軟件進(jìn)行分子方差分析（AMOVA），計(jì)算Tajima’s D和Fu’s Fs值，進(jìn)行核苷酸不配對(duì)分析，獲得τ值；用公式τ=2ut估算種群擴(kuò)張時(shí)間（Rogers et al，1992），其中τ是擴(kuò)張時(shí)間參數(shù)；u=μk，μ為控制區(qū)基因的變異速率，k表示序列長(zhǎng)度；t表示自擴(kuò)張以來(lái)所經(jīng)歷的代數(shù)；擴(kuò)張時(shí)間T=t×生殖周期。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體控制區(qū)的序列特征以及遺傳多樣性

獲得線粒體控制區(qū)5’端序列549 bp，發(fā)現(xiàn)3個(gè)插入/缺失位點(diǎn)，24個(gè)變異位點(diǎn)，11個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)；共有3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換，沒(méi)有顛換，轉(zhuǎn)換與顛換比為6.25，符合線粒體基因組DNA進(jìn)化過(guò)程中轉(zhuǎn)換頻率高于顛換的規(guī)律，說(shuō)明序列沒(méi)有達(dá)到飽和，適合遺傳分析。序列中A、T、C、G的含量分別為35.3%，29.5%，19.7%，15.5%，表現(xiàn)出明顯的反G偏倚；A+T含量（64.8%）高于C+G含量（35.2%），符合魚類線粒體DNA的一般規(guī)律（Hochachka，1993）。

群體遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表1。4個(gè)角木葉鰈群體總體的單倍型多樣性（Hd） 為0.979±0.008，核苷酸多態(tài)性（Pi）為0.006 55±0.003 7。群體內(nèi)單倍型多樣性在0.974±0.039～0.989±0.031之間，核苷酸多態(tài)性在 0.006 33±0.003 8～0.006 93±0.004 2之間，呈現(xiàn)單倍型多樣性較高而核苷酸變異較低的特點(diǎn)。

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)及種群歷史動(dòng)態(tài)

4個(gè)群體中共有37個(gè)單倍型，其中9個(gè)為共享單倍型；以Hap6出現(xiàn)次數(shù)最多，為4個(gè)群體所共享；其余單倍型為各個(gè)群體所特有。在以K-2-p模型構(gòu)建的單倍型NJ樹（圖1） 中，不同地理來(lái)源的單倍型散亂分布，沒(méi)有呈現(xiàn)明顯的地理結(jié)構(gòu)和譜系結(jié)構(gòu)。4個(gè)群體間遺傳距離在0.006～0.007之間，群體內(nèi)個(gè)體間平均遺傳距離為0.006 5，群體內(nèi)和群體間的遺傳距離處于同一水平，表明角木葉鰈群體遺傳分化較低。另外，兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)均為負(fù)值（見(jiàn)表2），且AMOVA分析顯示群體間的變異為-2.15%，而群體內(nèi)個(gè)體間變異高達(dá)102.15%（P＞0.05），進(jìn)一步表明4個(gè)地理群體間基因交流頻繁，并無(wú)顯著遺傳分化（Wright，1978a）。

表1 角木葉鰈4個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)

圖1 基于角木葉鰈線粒體控制區(qū)序列構(gòu)建的單倍型鄰接樹（分支上數(shù)字為Bootstrap值）

表2 角木葉鰈4個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)（Fst）

高單倍型多樣性與低核苷酸多態(tài)性的分布模式提示角木葉鰈可能經(jīng)歷了種群擴(kuò)張（Bowen et al，1997）。將所有個(gè)體作為一個(gè)整體，進(jìn)行Tajima’s D和 Fu’s Fs中性檢驗(yàn)得 Tajimas’D=-1.31736（P＞0.10），F(xiàn)u’s Fs=-40.296（P=0.000），即 Tajimas’D值不顯著，而Fu’s Fs值顯著。由于在相同條件下，F(xiàn)u’s Fs檢驗(yàn)對(duì)群體擴(kuò)張非常敏感（Fu，1997），故可認(rèn)為角木葉鰈可能經(jīng)歷過(guò)快速的種群擴(kuò)張。另外將整體進(jìn)行核苷酸不配對(duì)分析，結(jié)果呈單峰分布（見(jiàn)圖2），同樣說(shuō)明角木葉鰈曾經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張。根據(jù)τ的觀測(cè)值3.8，以5%～20%每百萬(wàn)年線粒體控制區(qū)變異速率（Liu et al，2007），以生殖周期為3，可估出種群擴(kuò)張發(fā)生在更新世中期到晚期之間（20.8～5.2萬(wàn)年）。

圖2 角木葉鰈整體的核苷酸不配對(duì)分析圖

3 討論

3.1 角木葉鰈的遺傳多樣性與種群動(dòng)態(tài)

遺傳多樣性豐富與否常用單倍型多樣性、核苷酸多態(tài)性來(lái)衡量（Vrijenhoek，1994）。本研究中角木葉鰈整體的單倍型多樣性為0.979±0.008，核苷酸多態(tài)性為0.006 55±0.003 7；4個(gè)群體的單倍型多樣性和核苷酸多態(tài)性分別在0.974±0.039～0.989±0.031和 0.00633±0.0038～0.00693±0.0042之間，呈現(xiàn)高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性分布模式，推測(cè)可能經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)后的快速擴(kuò)張（Frankham et al，2002），中性檢測(cè)和核苷酸不配對(duì)分析也證實(shí)了這種推測(cè)。角木葉鰈出現(xiàn)這種分布模式的可能原因是單倍型多樣性可在短時(shí)間內(nèi)積累變異而快速提高，而核苷酸多態(tài)性短時(shí)間內(nèi)達(dá)不到這種程度，從而導(dǎo)致高單倍型多樣性與低核苷酸多態(tài)性現(xiàn)象的出現(xiàn)。中國(guó)沿海的白姑魚（韓志強(qiáng)，2008）、花鱸（Liu et al，2006）、小黃魚（彭博 等，2010）、真鯛（樂(lè)小亮 等，2010）、黑鯛（趙爽等，2010）、鰳魚（吳常文等，2009）、黃鰭鯛（龔金波，2006）等都可能經(jīng)歷過(guò)類似于角木葉鰈的種群擴(kuò)張。更新世中、晚期冰期旋回導(dǎo)致海平面多次大幅升降，海平面曾比今日低130多米，中國(guó)沿海大陸架大面積露出（Wang，1999），之后又被淹沒(méi)，導(dǎo)致許多魚類的棲息地經(jīng)歷了冰期的縮減和冰期后期的擴(kuò)張，從而形成現(xiàn)代種群的遺傳格局（Hewitt，2000）。

3.2 角木葉鰈的遺傳分化

4個(gè)角木葉鰈群體內(nèi)與群體間的遺傳距離都很小（0.006～0.007），遠(yuǎn)小于Shaklee在1982年提出的魚類在屬、科、種上遺傳距離分別是0.9，0.3，0.05 的分類標(biāo)準(zhǔn)（Shaklee et al，1982）；群體間遺傳分化指數(shù)均為負(fù)值且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著；AMOVA分析也顯示個(gè)群體間存在的地理隔離未對(duì)遺傳變異的分布產(chǎn)生顯著影響；這些都表明4個(gè)角木葉鰈群體間并無(wú)明顯的遺傳分化（Wright，1978b）。這種現(xiàn)象在海洋魚類中較為常見(jiàn)（Palumbi，1994），可能原因如下：一是角木葉鰈在我國(guó)沿海廣泛分布，雖然成魚游泳能力較弱，但每年春、夏季臨近時(shí)集群自越冬場(chǎng)游向近海產(chǎn)卵。其卵是漂浮性的，幼體也可能會(huì)隨海流被動(dòng)漂流，加上我國(guó)沿海并不存在明顯影響基因交流的地理障礙，導(dǎo)致群體間基因交流頻繁，分化程度不顯著。二是經(jīng)歷冰期之后的角木葉鰈幸存?zhèn)€體進(jìn)行了大范圍的擴(kuò)張，但其擴(kuò)張時(shí)間尚短，尚未在遷移和遺傳漂變間達(dá)到平衡（Palumbi，2003）。

3.3 角木葉鰈種質(zhì)資源的管理和保護(hù)

中國(guó)近海角木葉鰈群體呈現(xiàn)高單倍型多樣度和低核苷酸多態(tài)度分布模式，沒(méi)有明顯的地理和譜系結(jié)構(gòu)，可作為一個(gè)管理保護(hù)單位（Moritz，1994）。近年來(lái)過(guò)度捕撈、海洋污染和產(chǎn)卵場(chǎng)受到破壞等原因，應(yīng)該采取措施保護(hù)角木葉鰈的野生資源。本研究中涉及的地理群體較少，同時(shí)僅根據(jù)線粒體控制區(qū)還尚不足以全面揭示中國(guó)近海角木葉鰈群體中可能存在的細(xì)微種群遺傳結(jié)構(gòu)，為更好地管理保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用角木葉鰈資源，還應(yīng)該采用進(jìn)化速率更快的AFLP或SSR等分子標(biāo)記技術(shù)，并綜合傳統(tǒng)的漁業(yè)調(diào)查和生理生態(tài)資料，盡可能準(zhǔn)確地摸清角木葉鰈的資源狀況，從而更好地保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用角木葉鰈種質(zhì)資源。

Bowen B W，Grant W S，1997.Phylogeography of the sardines：Assessing the Biogeographical models and population history in temperate upwelling zones.Evolution，51（5）：1601-1610.

Flesenste J，1985.Confidence limits on phylogenies：An approach using the bootstrap.Evolution，39（4）：783-791.

Frankham R，Ballou J D，Briscoe D A，2002.Introduction to Conservation Genetics.Cambridge：Cambridge University Press.

Fu Y X，1997.Statistical tests of neutrality of mutations against population grownth，hitchhiking and background selection.Genetics，147（2）：915-925.

Hewitt G M，2000.The genetic legacy of the quaternary ice ages.Nature，405： 907-913.

Hochachka P W，Mommsen T，1993.Biochemistry and Molecular Biology of Fishes：Environmental and Ecological Biochemistry.Elsevier Science，2： 1-38.

Kocher T D，Carleton K L，1997.Base substitution in Fish mitochondrial DNA：patterns and rates.In：Kocher T D，Stepien C A eds.Molecular systematic of fishes.Academic Press，13-24.

Liu J X，Gao T X，Yokogawa K，et al，2006.Differential population structuring and demographic history of two closely related fish species，Japanese sea bass（Lateo-labrax japonicus） and spotted sea bass（Lateolabrax maculatus） in Northwestern Pacific.Molecular Phy-logenetics and Evolution，39（3）：799-811.

Liu J X，Gao T X，Wu S F，et al，2007.Pleistocene isolation in the Northwestern Pacific marginal seas and limited dispersal in a marinefish，Chelon haematocheilus（Temminck&Schlegel，1845）.Molecular Ecology，16（2）：275-288.

Millers A，Dykes D D，Poleskyh F，1988.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells.Nucleic Acids Research，16（3）：12-15.

Moritz C，1994.Defining‘Evolutionarily Significant Units’for conservation.Trends Ecol Evol，9（10）：373-375.

Nelson J S，2006.Fish of the World（4th ed）.New York： John Wiley&Sons.Inc.，442-452.

Palumbi S R，1994.Genetic divergence，reproductive isolation，andmarine speciation.Annual Review of Ecology and Systematics，25（1）：547-572.

Palumbi S R，2003.Population genetics，demographic connectivity，and the design of marine reserves.Ecology Application，13： 146-158.

Rogers A R，Harpending H，1992.Population growth makes waves in the distribution of pairwise genetic differences.Mol Biol Evol，9（2）：552-569.

Shaklee J B，Tamaru C S，Waples R S，1982.Speciation and evolution of marine fishes studied by electrophoresis analysis of proteins.Pac Sci，36（2）：141-157.

Wang P X，1999.Response of western pacific marginal seas to glacial cycles：paleoceangraphic and edimentological features.Mar Geol，156：5-39.

Ward R D，2000.Genetics in fisheries management.Hydrobiologia，420：191-200.

Wright S，1978a.Evolution and genetics of populations.Chicago：University of Chicago press.

Wright S，1978b.Evolution and the Genetics of Population：Variability within and among Natural Population.Chicago：University of Chicago Press，79-103.

Vrijenhoek R C，1994.Genetic diversity and fitness in small populations In：Loeschcke V，Tomiuk J，Jian S K eds.Conservation Genetics.Basel：Birkh user，37-53.

程慶賢，肖蘭芳，1991.我國(guó)海洋生態(tài)環(huán)境面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題.海洋通報(bào)，10（6）：68-72.

陳四清，于東祥，馬愛(ài)軍，等，2002.圓斑星鰈生物學(xué)特性研究.現(xiàn)代漁業(yè)信息，17（10）：25-27.

龔金波，2006.中國(guó)近海兩種鯛科魚類的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分析.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，13-36.

韓志強(qiáng)，2008.三種海洋魚類分子系統(tǒng)地理學(xué)研究.中國(guó)海洋大學(xué)，16-31.

韓志強(qiáng)，莊志猛，高天翔，等，2006.半滑舌鰨DNA的群體遺傳變異.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，13（1）：13-19.

孟天湘，任勝民，1986.渤海黃蓋鰈的年齡與生長(zhǎng).海洋學(xué)報(bào)，8（2）：221-223.

蒙子寧，莊志猛，金顯仕，等，2003.黃海和東海小黃魚遺傳多樣性的RAPD分析.生物多樣性，11（3）：197-203.

彭博，章群，趙爽，等，2010.中國(guó)近海小黃魚遺傳變異的細(xì)胞色素b序列分析.廣州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2：131-135.

吳常文，許逸天，呂振明，等，2009.基于D-Loop基因的中國(guó)沿海鰳魚種群遺傳結(jié)構(gòu)研究.海洋與沼澤，3：330-337.

樂(lè)小亮，章群，趙爽，等，2010.中國(guó)近海真鯛遺傳變異的線粒體控制區(qū)序列分析.廣州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2：136-139.

趙爽，章群，樂(lè)小亮，等，2010.中國(guó)近海5個(gè)黑鯛地理群體的遺傳變異.海洋科學(xué)，34（2）：75-79.

（本文編輯：袁澤軼）

Genetic diversity of four Pleuronichthys cornutus populations in coastal waters of China

ZHU Ye，ZHANG Qun，LI Gui-sheng，LIU Hai-lin，MA Ben，HUANG Xiao-yu，SI Cong-li
（Research Center of Hydrobiology，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Q347

A

1001-6932（2012）05-0552-05

2012-02-15；

2012-06-26

國(guó)家自然科學(xué)基金（30770415，41071034）；暨南大學(xué)科研創(chuàng)新基金（21609710，21611426）。作者簡(jiǎn)介：朱葉（1986-），女，廣州，碩士研究生，細(xì)胞生物學(xué)方向。電子郵箱：zhu9ye@126.com。