馬朝陽，傅倩云，欒 霄，黃 超

1江南大學(xué)食品學(xué)院;2江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，無錫 214122

玫瑰紅景天(Rhodiola rosea)在中國(guó)和東歐國(guó)家是一種有名的傳統(tǒng)藥用植物，具有去疲勞、增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高工作效率、耐缺氧、改善睡眠、預(yù)防高原病、抗癌等多種生理功能［1］，目前是一種很受歡迎的藥食兩用“適應(yīng)原”植物。多酚是其抗氧化活性成分。目前對(duì)玫瑰紅景天酚性成分分離的主要方法是多步柱色譜［2，3］，其主要的缺點(diǎn)是分離過程復(fù)雜、回收率低、大量消耗有機(jī)溶劑。近來，高速逆流色譜(HSCCC)作為一種現(xiàn)代分離技術(shù)可以很好彌補(bǔ)柱色譜技術(shù)的缺陷，在天然活性成分的分離上正得到越來越廣泛的應(yīng)用。

HSCCC是20世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)。由于不使用固態(tài)支持介質(zhì)，避免了因不可逆吸附引起的樣品損失、失活變性等現(xiàn)象，具有樣品無損失、無污染、高效、快速等優(yōu)點(diǎn)。目前，高速逆流色譜已被廣泛應(yīng)用于天然藥物成分的分離制備和中藥的分析鑒定中，應(yīng)用HSCCC可以分離純化黃酮、生物堿、皂苷等有效成分［4］。同時(shí)具有制備量大，分離效果好，速度快等優(yōu)勢(shì)。

目前還沒有使用HSCCC方法分離玫瑰紅景天酚性化合物的報(bào)道。本研究的主要目的是形成一種簡(jiǎn)單有效的HSCCC方法同時(shí)純化玫瑰紅景天提取物中的三種酚性化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品的提取及HSCCC分離的試劑(正己烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇)均為分析純;水為二次蒸餾水;UPLC流動(dòng)相為色譜純?cè)噭?玫瑰紅景天提取物(西安小草科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

TBE-300A高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司);?KTA泵系統(tǒng)配有紫外吸收檢測(cè)器和分步收集器(瑞士通用電氣醫(yī)療集團(tuán));HX-1050恒溫循環(huán)器(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);WATERS ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司);BC-202B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司);DL-360B超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);TOF-MS質(zhì)譜儀(沃特世公司，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶劑系統(tǒng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)使用UPLC法來測(cè)定三種紅景天多酚樣粗品中各組分的分配系數(shù)K值，來確定用于高速逆流色譜分離的兩相溶劑體系。測(cè)定方法如下:配得不同比例的溶劑體系10 mL，加入2.5 mg玫瑰紅景天樣品超聲溶解后靜置2 h，分別取上下相溶液2.5 mL濃干，分別用10 mL乙醇溶解后取1 mL溶液進(jìn)行UPLC測(cè)定，測(cè)得上下相的峰面積為A1和A2。分配系數(shù)K則按下式計(jì)算:K=A1/A2。選取待分離組分的K值為0.2～5，且不同相鄰組分K值之比大于1.2的兩相溶劑體系作為高速逆流色譜分離過程中的兩相溶劑體系。

1.3.2 樣品前處理

稱取紅景天粗品65.00 g，水溶解后以1 BV/h上裝有1L聚酰胺樹脂的層析柱(5.6×60 cm)富集酚性化合物，上樣結(jié)束后，用1.5 BV水洗柱除去不被吸附的成分，然后用95%乙醇洗脫，洗脫物濃干得7.83 g酚性化合物，最后過裝有250 mL的硅膠柱(3.5×50 cm)，收集650 mL乙酸乙酯-甲醇(16∶1，v/v)洗脫物，濃干得2.38 g固形物，用于HSCCC分離。

1.3.3 制備兩相溶劑系統(tǒng)和樣品溶液

將正己烷、乙酸乙酸、醋酸、水(體積比4∶5∶4∶5)置于分液漏斗中，充分振搖后靜置24 h，將上相和下相分開，超聲脫氣20 min后使用。取150 mg的前處理后的固形物溶于15 mL上相流動(dòng)相作為進(jìn)樣樣品。

1.3.4 HSCCC分離

用泵將固定相(上相)以25 mL/min的流速泵入HSCCC分離柱，固定相充滿色譜柱后，打開主機(jī)，轉(zhuǎn)速定為800 rpm，以3 mL/min的流速泵入流動(dòng)相(下相);待整個(gè)系統(tǒng)建立動(dòng)態(tài)平衡后(1.5 h)，流速調(diào)為1.5 mL/min，由六通進(jìn)樣閥進(jìn)樣，進(jìn)行HSCCC分離。分離過程中根據(jù)紫外檢測(cè)圖譜，接收目標(biāo)成分，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。收集到的各部分樣品溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干真空干燥得相應(yīng)的固體成分。

1.3.5 UPLC-TOF-MS分析

將收集到的紅景天多酚各組分進(jìn)行UPLC-TOFMS分析，分析條件:采用UPLCTMBEH C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)(Waters，USA)，流動(dòng)相為乙腈(0.1%，v/v)-甲酸水溶液，梯度洗脫程序如下，0～8 min，5% ～40%乙腈;8 ～12 min，40% ～100% 乙腈。流速0.3 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件如下:離子源為ESI，分析模式為負(fù)離子模式。脫溶劑溫度400℃，離子源溫度100℃，錐孔氣體流速50 L/Hr，毛細(xì)管電壓3000 V，樣品錐孔電壓20.0 kV，提取錐孔電壓4.0 kV，捕獲氣體流速1.5 mL/min，載氣流速24 mL/min。質(zhì)譜掃描范圍m/z 100～1000。

1.3.6 三種化合物1H NMR譜測(cè)定

將三種化合物溶于氘代試劑中，其中化合物1和化合物2溶于氘代甲醇，化合物3溶于氘代氯仿中，在400MHz的 Avance核磁共振儀(Bruker，瑞士)上測(cè)定氫譜，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

成功的HSCCC分離很大程度上依賴尋找合適的溶劑系統(tǒng)，可以提供理想的分配系數(shù)K值，實(shí)際的K值一般落在0.2～5的范圍內(nèi)。參考Ito方法［5］，由于所要分離的組分可以溶于乙酸乙酯，所以溶劑系統(tǒng)的篩選從乙酸乙酯-水(1∶1，v/v)開始，此時(shí)三種目標(biāo)成分的K值偏大(表1)，說明主要分配在上相，作為HSCCC溶劑系統(tǒng)不合適。溶劑系統(tǒng)的搜尋偏向脂溶性更強(qiáng)的溶劑體系-正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)，而此時(shí)的 K 值又太小，目標(biāo)成分很快洗出分離效果差。溶劑系統(tǒng)的搜尋在此基礎(chǔ)上往脂溶性稍弱的溶劑系統(tǒng)［6，7］正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶5∶4∶5)，此時(shí)目標(biāo)成分的K值落在合適的范圍說明可以作為HSCCC分離的溶劑系統(tǒng)。

表1 溶劑系統(tǒng)的選擇Table 1 Selection of solvent system

2.2 高速逆流色譜分離結(jié)果

在制備HSCCC分離過程中，進(jìn)樣量被優(yōu)化，當(dāng)進(jìn)樣量在80～150 mg范圍內(nèi)沒有流動(dòng)相和分辨率的損失，進(jìn)一步增加進(jìn)樣量時(shí)會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相的流失使分離失敗，因此進(jìn)樣量選150 mg。在分離過程中，由于化合物3的分配系數(shù)較大，意味著長(zhǎng)的洗脫時(shí)間。所以當(dāng)化合物1和化合物2洗脫出來175 min鐘后，流動(dòng)相流速從開始的1.5 mL/min采用增大到3.0 mL/min，從而減小化合物3的出峰時(shí)間。三種化合物分離的HSCCC色譜圖如圖1所示。150 mg樣品經(jīng)HSCCC分離后得到化合物1:68.5 mg、化合物2:8.5 mg、化合物3:45.5 mg，根據(jù)UPLC中峰面積比例可以得到它們的純度分別達(dá)到99.1%、98.5%、99.4%。三種化合物的UPLC色譜圖如圖2所示。

2.3 三種化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

三種化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)(圖3)和1H NMR數(shù)據(jù)如下:

化合物 1:C7H5O5，［M-H］-169.0124(error:5.5 ppm);1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ;7.08(2H，s，H-2，6)。

圖1 分離三種化合物的HSCCC色譜圖Fig.1 HSCCC chromatography of pre-treated Rhodiola rosea extract

圖2 粗分離樣品及純化的三種化合物的超高效液相色譜圖，其中圖A為粗分離樣品，化合物1(圖D)為沒食子酸、化合物2(圖C)為沒食子酸甲酯、化合物3(圖B)為山奈酚Fig.2 UPLC chromatograms of the pre-treated crude extract(A)，the purified compound 1(D)，compound 2(C)and compound 3(B)

化合物2:C8H7O5，［M-H］-183.0293(error:5.5 ppm);1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.06(2H，s，H-2，6)，3.90(2H，s，-CH3)。

化合物3:C15H9O6，［M-H］-285.0399(error:5.2 ppm);1H NMR(400 MHz，CDCl4)δ:8.11(2H，d，J=8.7 Hz，H-2’，6’)，6.93(d，J=8.7 Hz，H-3’，5’)，6.40(1H，J=2.0 Hz，H-6)，6.19(d，J=2.0 Hz，1H)。

基于以上數(shù)據(jù)，三種化合物鑒定為沒食子酸(Gallic acid)［8］，沒食子酸甲酯(Methyl gallate)，山奈酚(Kaempferol)［9］。

圖3 三種化合物的電噴霧質(zhì)譜圖，化合物1:沒食子酸;化合物2:沒食子酸甲酯;化合物3:山奈酚Fig.3 ESI-MS spectra of three separated constituents，compound 1:Gallic acid;compound 2:Methyl gallate;compound 3:Kaempferol

3 結(jié)論

本文應(yīng)用高速逆流色譜分離玫瑰紅景天酚性化合物，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶5∶4∶5，v∶v∶v∶v)作為制備型逆流色譜分離的溶劑系統(tǒng)，分離得到3個(gè)酚性化合物，單體化合物的純度經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)均高于98%。將HSCCC與常規(guī)柱色譜分離方法相結(jié)合，可以提高分離效率，在天然活性成分的分離純化方面有廣闊的應(yīng)用前景。

1 Panossian A，Wikman G，Sarris J.Rosenroot(Rhodiola rosea):traditional use，chemical composition，pharmacology and clinical efficacy.Phytomed，2010，17:481-493.

2 Bao WF(包文芳)，Wu WC(吳維春)，Zhang W(張薇).I-solation and identification of domestic Rose Rhodiola watersoluble components.Chin J Med Chem(中國(guó)藥物化學(xué)雜志)，2000，10:209-210.

3 Zapesochnaya GG，Kurkin VA.Glycosides of cinnamyl alcohol from the rhizomes of Rhodiola rosea.Chem Nat Comp，1983，18:685-688.

4 Han X，Zhang T，Wei Y，et al.Separation of salidroside from Rhodiola crenulata by high-speed counter-current chromatography.J Chromatogr A，2002，971:237-241.

5 ItO Y.Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography.J Chromatogr A，2005，1065:145-168.

6 Ouyang XK，Jin MC，He CH.Preparative separation of four major alkaloids from medicinal plant of Tripterygium wilfordii Hook F using high-speed counter-current chromatography.Sep Purific Technol，2007，56:319-324.

7 Yanagida A，Yamakawa Y，Noji R，et al.Comprehensive separation of secondary metabolites in natural products by highspeed counter-current chromatography using a three-phase solvent system.J Chromatogr A，2007，1151(1/2):74-81.

8 Jiao QY(焦啟揚(yáng))，Wu LJ(吳立軍)，Huang J(黃建)，et al.Chemical constituents from the involucre of Castanea mollissima Blume.J Shenyang Pharm Univ(沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào))，2009，1:26-29.

9 Liu JL(劉俊嶺)，Re N(熱娜)，Du NS(堵年生).Chemical constituents from the root of Rhodila pamiera.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2000，12(3):30-33.