顧鵬毅，代 萌，楊 棟，高 娜，李寧禾，孫晉民*

1中國醫(yī)科大學(xué)實驗技術(shù)中心一部暨國家中醫(yī)藥管理局中藥生物工程科研Ⅲ級實驗室，沈陽 110001;2朝陽市衛(wèi)生學(xué)校，朝陽 122000

神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中最早被發(fā)現(xiàn)，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促進(jìn)突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，其臨床應(yīng)用前景廣闊。NGF對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用［1］。NGF具有多種營養(yǎng)性生物學(xué)效應(yīng)，表現(xiàn)在對胚胎發(fā)育期神經(jīng)元的作用，促進(jìn)生后發(fā)育神經(jīng)元的生長，維持成熟神經(jīng)元的存活，促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)與再生，對神經(jīng)變性性疾病的作用，對腫瘤的潛在性治療作用，在炎性疾病中的作用以及在糖尿病周圍神經(jīng)病變中的治療作用。微量元素鋅是NGF的重要結(jié)構(gòu)元素，在腦中的分布不均衡，其中尤以海馬結(jié)構(gòu)最高。目前，NGF的主要來源是雄性小鼠的頜下腺、蛇毒、豚鼠前列腺、牛精液等，臨床較多的采用小鼠頜下腺、蛇毒來源以及基因工程產(chǎn)品人重組NGF(rhNGF)，其對人的神經(jīng)組織有明顯的作用，國內(nèi)外文獻(xiàn)已有很多報道。牛腦體積較大，來源廣泛，以牛腦為原料分離純化NGF或?qū)⒊蔀槠淞硪恢匾獊碓础１狙芯繌男迈r牛腦中分離純化NGF，并進(jìn)行活性檢測，以期為進(jìn)一步應(yīng)用性研究打好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品、試劑

新鮮牛腦;標(biāo)準(zhǔn)品 rhNGF(Sigma);NGF抗體(Sigma);磷酸鹽緩沖液(0.2 M，pH 6.8);醋酸鹽緩沖液(0.2 M，pH 4.0);Tris-HCl緩沖液(0.05 M，pH 9.0);PC12細(xì)胞(ATCC:CRL-1721，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。

1.1.2 儀器

層析系統(tǒng)(?KTA purifier 100，GE);原子吸收分光光度計(180-80，Hitachi);電泳凝膠成像系統(tǒng)(CHEMI IMAGER 5500);Motic Imang Andvaned 3.2圖像分析系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1 粗提物的制備

取新鮮牛腦海馬，經(jīng)勻漿、均質(zhì)得乳白色懸濁液，離心13000 rpm ×30 min，得粗提物上清液，80%(NH4)2SO4沉淀，離心棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液(0.2 M，pH 6.8)溶解。

1.2.2 分離純化

將鹽析后的溶液置于透析袋中，醋酸鹽緩沖液(0.2 M，pH 4.0)透析過夜，將透析后的液體離心12000 rpm ×5 min，取上清液，用CM-FF層析柱進(jìn)行離子交換層析。

1.2.3 Western Blot及活性測定

1.2.3.1 Western Blot

選用T=10%，C=3%的SDS-PAGE，一抗為兔的β-NGF單克隆抗體，二抗為羊抗兔的IgG，堿性磷酸酶顯色法顯色。

1.2.3.2 活性測定［2-5］

用PLL包被24孔板，含3%馬血清、12%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×103個/mL，得到PC12細(xì)胞懸液。每孔加入100 μL試樣，100 μL 0.1 M 乙醇，800 μL 細(xì)胞懸液，37 ℃，5%CO2孵育72～120 h后，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。利用Motic Imang Andvaned 3.2圖像分析系統(tǒng)，測量細(xì)胞分化情況，選取3個視野的細(xì)胞/細(xì)胞團(tuán)，分別測量每個視野中分化細(xì)胞的最長軸突的長度，計算出每個濃度下的最長軸突的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以軸突生長長度大于細(xì)胞最大直徑為細(xì)胞已分化標(biāo)準(zhǔn)，計數(shù)各視野細(xì)胞，若在該濃度下≥95%的PC12細(xì)胞已分化，認(rèn)為該濃度具有生物學(xué)活性。

1.2.4 微量元素的測定

利用原子吸收分光光度計測定其微量元素，根據(jù) Zn、Fe、Cu 的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL)將測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別測定粗提物和CM2組分中的Zn、Fe、Cu的含量。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，進(jìn)行t檢驗及χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 分離純化

牛腦海馬粗提物經(jīng)起始緩沖液透析過夜，再經(jīng)CM柱離子交換層析，在起始緩沖液和洗脫緩沖液的作用下，得到穿透峰和2個洗脫峰:CM1峰、CM2峰，其中CM2峰在pH值陡然上升時出現(xiàn)，且蛋白濃度相對較高，為NGF的主要含量峰，其層析結(jié)果見圖1。

圖1 離子交換層析結(jié)果Fig.1 Ion-exchange chromatogram of bovine brain hippocampus

2.2 Western Blot及活性測定

2.2.1 Western Blot

結(jié)果顯示55 KD、70 KD左右位置有兩條清楚帶，均含有β亞基，如圖2所示。

圖2 Western Blot結(jié)果圖Fig.2 Western Blot of NGF

2.2.2 生物活性檢測

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果

各實驗組均長出纖維突觸，靈敏度可達(dá)1 ng/mL，0.1 M乙醇有較好的促分化作用。標(biāo)準(zhǔn)品NGF在濃度1～5 ng/mL時使PC12細(xì)胞長出纖維突觸，細(xì)胞體積增大，核清晰，可見核仁。分別對1、2、4、5和10 ng/mL濃度下細(xì)胞分化情況進(jìn)行測量，測量結(jié)果分別為 40.29 ± 3.43 μm、54.34 ± 12.15 μm、186.66 ± 7.91 μm、240.38 ± 32.07 μm、181.62 ±20.31 μm，5 ng/mL的濃度對PC12細(xì)胞的誘導(dǎo)效果最佳，見圖3-B。

2.2.2.2 分離組分測量結(jié)果

分別對標(biāo)準(zhǔn)品NGF、粗提物、透析后組分、CM1組分和CM2組分作用下的細(xì)胞分化情況進(jìn)行測量，選取3個視野的細(xì)胞/細(xì)胞團(tuán)，分別測量每個視野中分化細(xì)胞的最長軸突的長度，測量結(jié)果見表1，其中CM2組分作用下的細(xì)胞軸突生長情況如圖3-C所示。CM2組分促PC12細(xì)胞軸突生長作用不及5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品NGF，但滿足判定標(biāo)準(zhǔn)，其效果優(yōu)于2 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品NGF。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品NGF及CM2組分對PC12細(xì)胞分化的作用(A.空白對照組;B.5 ng/mL NGF標(biāo)準(zhǔn)品組;C.CM2分離組分組)Fig.3 PC12 cell differentiation effects of NGF standard and CM2 component(A.Blank control;B.5 ng/mL NGF standard;C.CM2 component)

表1 標(biāo)準(zhǔn)品NGF及分離組分的蛋白濃度和生物學(xué)活性()Table 1 Protein concentration and biological activity of NGF standard and purified components)

表1 標(biāo)準(zhǔn)品NGF及分離組分的蛋白濃度和生物學(xué)活性()Table 1 Protein concentration and biological activity of NGF standard and purified components)

*ND意為未檢測到(ND means not detected).

組分Components蛋白濃度Protein concentration(mg/mL)PC12細(xì)胞分化最長軸突長度The length of the longest axon of PC12 cell differentiation(μm)標(biāo)準(zhǔn)品NGF NGF standard 5×10-6240.38±32.07粗提物Crude extract 8.107 10.32±4.51透析Dialysis 1.105 39.21±3.43 CM2component 0.4856 107.90±10.33層析Chromatography CM1組分CM1component 0.2372 ND*CM2組分

圖4 牛腦海馬粗提物與CM2組分中Zn、Fe、Cu含量Fig.4 The content of Zn，F(xiàn)e，Cu in crude extracts of the bovine hippocampus and CM2 component

2.3 微量元素測定結(jié)果

分別對牛腦海馬粗提物及CM2組分進(jìn)行微量元素的測定，經(jīng)t檢驗表明:牛腦海馬粗提物的微量元素中Zn與Cu含量無差別，F(xiàn)e與Zn、Cu有差異(P ＜0.01)，見圖4-A;CM2組分中Zn遠(yuǎn)高于Fe、Cu含量(P ＜0.01)，F(xiàn)e與Cu含量無差異，見圖4-B。

3 討論

本實驗得到的牛腦海馬NGF的分子量在55 KD、70 KD左右，為較大分子量的 NGF，與牛精漿［6］、人胎腦、大鼠腦［7］來源的 NGF 相比，含有的亞基不同。用標(biāo)準(zhǔn)品NGF對PC12細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，5 ng/mL的濃度下，誘導(dǎo)分化效果最佳。我們據(jù)此建立促神經(jīng)生長物質(zhì)檢測技術(shù)平臺［3，4］，應(yīng)用 0.1 M乙醇作為誘導(dǎo)劑，以5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品NGF濃度為陽性對照;采用圖像分析軟件，測量分化細(xì)胞的最長軸突的長度以及分化細(xì)胞的百分含量;根據(jù)對已分化細(xì)胞的直徑測量，以最長軸突大于50 μm時且分化細(xì)胞的百分含量＞50%作為標(biāo)準(zhǔn)。

必需微量元素是正常人體生命過程中不可缺少的元素，它參與人體的重要的生命活動過程，對人體的各種生理活動起影響、調(diào)節(jié)作用。鋅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有兩種存在形式，一種是與某些生物大分子牢固結(jié)合，如金屬蛋白酶中的鋅;另一種形式是與組織成份疏松結(jié)合，可以被鰲合劑螯合。鋅與機(jī)體的神經(jīng)內(nèi)分泌有一定關(guān)系，海馬有損傷出現(xiàn)時，可導(dǎo)致下丘腦釋放激素等活性物質(zhì)的水平發(fā)生改變。鋅對腦中的一些功能蛋白有調(diào)節(jié)作用，腦中可能有一種對神經(jīng)細(xì)胞增殖起抑制作用的含鋅蛋白，該蛋白與Alzheimer＇s癡呆的發(fā)生密切相關(guān)。鋅能促進(jìn)酶和蛋白質(zhì)合成，加速細(xì)胞的分裂和增殖，增加能量代謝、組織呼吸和保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。微量元素鋅在腦中的分布是不均衡的，以邊緣系統(tǒng)、皮質(zhì)部、扣帶回、齒狀回和海馬中含量較多，其中尤以海馬結(jié)構(gòu)和大腦皮層含量最高，嚙齒類動物的海馬鋅含量可高達(dá)133 μg/g干重。經(jīng)檢測牛腦海馬NGF中的微量元素Zn明顯高于Fe、Cu含量，這與NGF分子中含有Zn結(jié)構(gòu)相一致，Zn2+具有穩(wěn)定亞單位結(jié)構(gòu)的作用。

神經(jīng)生長因子具有促進(jìn)神經(jīng)纖維生長、調(diào)節(jié)神經(jīng)多肽的合成和表達(dá)的作用。目前研究表明，NGF是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖誘導(dǎo)劑［8］，對正常及瘢痕皮膚成纖維細(xì)胞的生長趨勢與增殖活性有明顯的促進(jìn)作用，促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)和創(chuàng)面愈合，對瘢痕皮膚的作用尤為明顯［9］。陳麗華等［10］研究發(fā)現(xiàn)NGF可以間接調(diào)節(jié)并增強(qiáng)面部皮膚的免疫功能，局部創(chuàng)面應(yīng)用后不但可以趨化各種免疫細(xì)胞，而且能對被趨化的免疫細(xì)胞致敏。有研究表明，NGF能影響肥大細(xì)胞的活性［11］，或許通過肥大細(xì)胞參與濕疹的發(fā)病。NGF作為一種生長因子，能促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，對神經(jīng)損傷有修復(fù)作用，同時還可促進(jìn)傷口愈合［12］。同時還通過刺激皮膚的表皮細(xì)胞增殖、更新，刺激真皮的膠原蛋白增生以實現(xiàn)其促進(jìn)傷口愈合等功能。我們課題組利用NGF研制的外用藥精制蛇毒酶乳膏，取得了良好的臨床效果。該項成果已獲得國家發(fā)明專利，這為NGF在外用藥方面的研究打下堅實的基礎(chǔ)。本研究是我們NGF研究系列之一，將為進(jìn)一步深入研究提供理論依據(jù)。

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