吳 慧，張 梁，朱圣潔，張正竹

安徽農業(yè)大學茶葉生物化學與生物技術教育部重點實驗室，合肥 230036

茶葉(Camellia sinensis)中的化學成分因氣候、季節(jié)、品種及葉齡的不同而有很大差異，主要以嘌呤類生物堿、鞣酸、酚酸類、兒茶素類、黃酮類以及黃烷醇聚合物為主［1，2］。但是，不同茶類之間，化學成分存在差異，綠茶因為是不發(fā)酵茶，因此保留了較多鮮葉中的天然成分，特別是茶多酚、咖啡堿和葉綠素等。生物堿和兒茶素類是綠茶的主要生物活性成分，兒茶素類化合物主要有表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、兒茶素(C)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、沒食子兒茶素(GC)及沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)。綠茶葉中以EGCG含量最高，占多酚類物質的48% ～55%［3］。咖啡堿含量約占鮮葉干重的2%～5%。

綠茶相對于其他茶類保留了大量的多酚類化合物，因而被認為具有較高的健康價值［4，5］;有研究證實綠茶具有抗誘變、抗癌、抗畸變等作用［6，7］，而這些健康成分大都存在于茶湯中。為深入了解綠茶水提物中的功能性成分，建立綠茶水提物中主要次生代謝產物的化合物標準庫，本文對綠茶水提物中的主要特征成分進行了分離和結構鑒定。

1 材料與儀器

1.1 材料

選用2010年加工的安徽皖南地區(qū)炒青綠茶;Sephadex LH-20(Pharmacia公司);Amberlite XAD-2大孔吸附樹脂(美國Sigma公司);硅膠H(青島海浪硅膠廠)。

1.2 儀器

旋轉蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司);電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司);真空干燥箱(德國MMM公司);高效液相色譜儀(美國Waters-600型);電子天平(上海天平儀器廠T6328B型);核磁共振儀(Varian 500MHz核磁共振分析儀器);液質聯用儀(Agilent 1200 series LC-MSD)。

2 提取與分離

稱取綠茶2 kg，用20 L開水浸泡15 min，反復提取兩次，過濾取濾液。綠茶水提取液10 L過大孔樹脂柱，柱體積1.5 L，先用足量的純水將樣品中的糖沖洗干凈，然后依次用比例為10%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇溶液洗脫，分別得到6個組分。將經過40%甲醇溶液洗脫得到的Fr.樣品(57 g)進行硅膠柱層析，分級洗脫(甲醇∶氯仿=14% ～33%)，TLC薄層色譜分析合并后得5個組分Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5，Fr.1過凝膠柱(丙酮∶水 =1∶1洗脫)得到化合物1、Fr.6和 Fr.7。Fr.6組分(13 g)經硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶丙酮∶水 =7∶1.5∶1∶0.1 洗脫)得到 Fr.8、Fr.9 和 Fr.10，Fr.8 經凝膠層析(甲醇洗脫)得到化合物6。Fr.10經凝膠層析(甲醇洗脫)得到Fr.12和Fr.13兩個組分，Fr.12經凝膠層析(甲醇洗脫)得到化合物3、化合物7和Fr.14，Fr.14再經凝膠層析(甲醇洗脫)得到化合物2。Fr.7組分(17 g)經硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶水=4∶1∶0.1 洗脫)得到 Fr.16 和 Fr.17(0.4246 g)，Fr.17再經硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶水∶甲酸 =10∶1∶0.1∶0.025洗脫)得到化合物4和化合物8。Fr.4組分(0.9 g)經硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶水∶甲酸=6∶1∶0.1∶0.2 洗脫)得到 Fr.19 和 Fr.20，Fr.20經凝膠層析(甲醇洗脫)純化后得到化合物5。

圖1 化合物1～8的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1-8

3 結構鑒定

化合物1 白色針狀結晶;ESI-MS(Positive)m/z:195［M+H］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.51(1H，s，H-8)，3.99(3H，s)，3.58(3H，s)，3.41(3H，s)。1H NMR數據與文獻報道的咖啡堿［8］一致。

化合物2 灰白色無定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:441［M-H］-;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:6.92(2H，s，H-2＇＇，H-6＇＇)，6.90(1H，d，J=1.9 Hz，H-2＇)，6.77(1H，dd，J=8.3，1.8 Hz，H-6＇)，6.67(1H，d，J=8.2 Hz，H-5＇)，5.94(2H，s，H-6，H-8)，5.49(1H，s，H-3)，4.99(1H，s，H-2)，2.82-2.96(2H，m，H-4)。1H NMR 數據與文獻報道的兒茶素沒食子酸酯［9］一致。

化合物3 棕色無定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:289［M-H］-;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:6.98(1H，d，J=1.7 Hz，H-2＇)，6.80(1H，dd，J=8.2，1.7 Hz，H-6＇)，6.76(1H，d，J=8.1 Hz，H-5＇)，5.95(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，5.92(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，4.82(H，s，H-2)，4.18(1H，s，H-3)，2.86(1H，dd，J=16.7，4.6 Hz，H-4b)，2.74(1H，dd，J=16.8，2.7 Hz，H-4a)。1H NMR 數據與文獻報道的表兒茶素［10］一致。

化合物4 白色無定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:183［M-H］-;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.05(2H，s，H-2，H-6)，4.84(br s，OH)，3.82(3H，s，OCH3)。1H NMR 數據與文獻報道的 3，5-二羥基-4-甲氧基苯甲酸［11］一致。

化合物5 黃色無定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:447 ［M-H］-，ESI-MS(Positive)m/z:471［M+Na］+，分子量為 448;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:8.09(2H，d，J=8.8 Hz，H-2＇，6＇)，6.88(2H，d，J=8.8 Hz，H-3＇，5＇)，6.41(1H，d，J=1.5 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=1.7 Hz，H-6)，5.14(1H，d，J=7.8 Hz，H-1＇＇)，3.44-3.79(m，sugar-H)。1H NMR數據與文獻報道的山柰酚-3-葡萄糖苷［12］一致。

化合物6 灰白色無定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:457［M-H］-;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:6.95(2H，s，H-2＇＇，H-6＇＇)，6.71(2H，m，H-2＇，H-6＇)，6.01 – 5.95(2H，m，H-6，H-8)，5.52(1H，d，J=1.8 Hz，H-3)，5.07(1H，d，J=10.1 Hz，H-2)，3.01(1H，dd，J=17.4，4.4 Hz，H-4a)，2.93 ～2.82(1H，m，H-4b)。1H NMR數據與文獻報道的沒食子兒茶素沒食子酸酯［10］一致。

化合物7 灰白色無定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:289 ［M-H］-;UV λmax nm(MeOH):225，280;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:4.48(br，d，J=7.5 Hz，H-2)，3.81(br，m，H-3)，2.65(dd，J=6.0，16.0 Hz，H-4a)，2.34(dd，J=6.0，16.0 Hz，H-4b)，5.89(d，J=2.0 Hz，H-6)，5.69(d，J=2.0 Hz，H-8)，6.72(d，J=2.0 Hz，H-2＇)，6.69(d，J=7.5 Hz，H-5＇)，6.60(dd，J=2.0 Hz，7.5 Hz，H-6＇)。1H NMR 數據與文獻報道的兒茶素［10］一致。

化合物8 白色針狀結晶;ESI-MS(Negative)m/z:169 ［M-H］-;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.03(2H，s，H-2，H-6)。1H NMR 數據與文獻報道的沒食子酸［13］一致。

4 討論

本實驗從綠茶中分離得到了8個化合物，研究表明綠茶末中仍然含有大量的多酚類物質，可以作為茶多酚類的提取原料，應用于保健食品等多個領域。

1 Perva-Uzunalic＇A，?kerget M，Knez ?，et al.Extraction of active ingredients from green tea(Camellia sinensis):extraction efficiency of major catechins and caffeine.Food Chem，2006，96:597-605.

2 Leung AY，Foster S.Encyclopedia of common natural ingredients used in food，drugs，and cosmetics，2nd ed.New York:John Wiley ＆ Sons，1996.489-491.

3 Ho CT，Chen CW，Wanasundara UN，et al.Natural antioxidants from tea in natural antioxidants.Champaign，IL:AOCS Press，1997.213-223.

4 Sueoka N，Suganuma M，Sueoka E，et al.A new function of green tea:prevention of lifestyle-related diseases.Ann Ny Acad Sci，2001，928:274-280.

5 McKay DL，Blumberg JB.The role of tea in human health:an update.J Am Coll Nutr，2002，21:1-13.

6 Gupta S，Saha B，Giri AK.Comparative antimutagenic and anticlastogenic effects of green tea and black tea:a review.Mutat Res-Rev Mutat，2002，512:37-65.

7 Kuroda Y，Hara Y.Antimutagenic and anticarcinogenic activity of tea polyphenols.Mutat Res-Rev Mutat，1999，436:69-97.

8 Fujii T，Saito T，Tamura K.Purines.XLIX.synthesis and proton nuclear magnetic resonance study of 3，7-dialkylxanthines and 1，3，7-trialkylxanthines.Chem Pharm Bull，1991，39:2855-2862.

9 Kumar NS，Rajapaksha M.Separation of catechin constituents from five tea cultivars using high-speed counter-current chromatography.J Chromatogr A，2005，1083:223-228.

10 Davis AL，Cai Y，Davies AP，et al.1H and13C NMR assignments of some green tea polyphenols.Magn Reson Chem，1996，34:887-890.

11 Saxena G，McCutcheon AR，Farmer S，et al.Antimicrobial constituents of rhus glabra.J Ethnopharmacol，1994，42(2):95-99.

12 Lu Y，Foo LY.The polyphenol constituents of grape pomace.Food Chem，1999，65:1-8.

13 Nawwar MAM，Buddrus J，Bauer H.Dimeric phenolic constituents from the roots of tamarix nilotica.Phytochemistry，1982，21:1755-1758.