張樹冰，周亞玲，李 凌，李 杰

中南大學生物科學與技術(shù)學院，長沙 410013

真菌竹黃(Shiraia bambusicola)是一種傳統(tǒng)的民間中藥，具有補中益氣、祛風利濕、抗菌消炎等功效，是一種非常值得開發(fā)利用的藥用真菌資源［1］。臨床上竹黃主治風濕性及類風濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、腰肌勞損、筋骨酸痛等［2］，其所含組分或成分，顯示了較強的藥理作用，具有保肝護肝、抗氧化、促凋亡、抗病毒、抗菌和抗腫瘤等功能［3-6］，其作用的有效部位、活性成分及作用機理等方面的研究尚處于起步階段。

腫瘤與炎癥具有非常緊密的關(guān)系，腫瘤與炎癥之間是一條雙向道:一方面炎癥對腫瘤發(fā)生具有促進作用;另一方面，腫瘤也可引發(fā)炎癥，彼此的信號通路之間存在著強烈對話，形成復雜的信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)［7，8］。腫瘤壞死因子 α(TNF-α)是一種主要由單核-吞噬細胞產(chǎn)生的細胞因子，可激活細胞凋亡和炎癥應(yīng)答等信號通路，這些信號通路之間相互關(guān)聯(lián)相互制約，對細胞的最終效應(yīng)取決于占主導地位的通路［9，10］。TNF-α 相關(guān)信號通路在腫瘤和炎癥之間的相互誘發(fā)、腫瘤及炎癥相關(guān)疾病治療過程中都起到非常重要的作用，是連接炎癥和腫瘤的一個調(diào)控關(guān)聯(lián)子［11］，介導腫瘤和炎癥信號通路之間的對話過程。

竹黃既具有抗炎特性又可以發(fā)揮抗腫瘤功能，而TNF-α信號通路與炎癥和腫瘤密切相關(guān)，我們推測竹黃的活性組分可能對TNF-α信號通路系統(tǒng)起到干預(yù)作用。最新研究也表明，成纖維細胞不僅在傷口愈合、組織缺陷和骨創(chuàng)傷修復等過程中發(fā)揮著積極作用，其也能對身體產(chǎn)生危害，與腫瘤生長與炎癥發(fā)生密切相關(guān)［12］。因此，我們以TNF-α誘導小鼠成纖維細胞(L929細胞)為模型，探討竹黃對該模型的作用方式，所涉及的TNF-α通路是腫瘤和炎癥相關(guān)信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，真菌竹黃可以雙向調(diào)節(jié)TNF-α誘導的L929細胞凋亡過程，高濃度竹黃提取物協(xié)同TNF-α誘導L929細胞凋亡;低濃度竹黃提取物可能通過抑制COX-2表達和促進BCL-2表達等作用抵抗TNF-α誘導L929細胞凋亡過程。

1 材料及方法

1.1 索式提取法獲得竹黃總提取物

竹黃子座于60℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，然后粉碎成粉末。稱取10 g竹黃粉末用濾紙包好，置于索式提取器中，加入75%的乙醇，樣料比為1∶6，電熱套加熱至提取器中回流的液體液體顏色很淺。收集紅色液體于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮提取液，將濃縮的提取液置于皿中，放在恒溫干燥箱中60℃干燥至恒重膏狀，稱取藥膏質(zhì)量。恒重竹黃藥膏加入DMSO溶解，配成50 mg/mL的藥物原液，4℃保存，實驗時按所需的工作濃度進行稀釋。

1.2 細胞培養(yǎng)

L929細胞以RPMI1640培養(yǎng)基中(含10%新生小牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中生長，3～4 d傳代1次。用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的L929細胞，消化90 s，去掉胰酶加入新鮮培養(yǎng)基，用彎頭吸管將細胞消化下來，收集于離心管中，取適量細胞懸液于血細胞計數(shù)板，進行計數(shù)，以每孔1×104細胞接種96孔板。待鏡下觀察細胞貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，加入含有藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞3 d。

1.3 細胞形態(tài)觀察和Hochest33258熒光染色

取對數(shù)生長期的L929細胞經(jīng)胰酶消化，計數(shù)，以5×104細胞/孔接種6孔板中培養(yǎng)，待細胞長至50% ～80%滿時，加入各設(shè)計濃度組處理細胞48 h。處理完畢，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL含4%多聚甲醛或70%乙醇的固定液，固定30 min。去固定液，用 PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次 3 min，加入 0.5 mL Hoechst 33258染色液，避光染色5 min。去染色液后，用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3 min。最后每孔加入0.5 mL PBS在倒置顯微鏡下觀察;熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)，可檢測到呈藍色的細胞核，凋亡細胞的核比正常細胞小，且亮度高。

1.4 磺酰羅丹明B(SRB)法繪制細胞生長抑制作用柱狀圖

首先，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入預(yù)冷的 100 μL10%三氯醋酸(TCA)溶液，4℃固定1小時，棄掉TCA固定液，1%醋酸溶液洗滌3遍，自然干燥后，每孔加入100 μL 0.4%SRB 染液，室溫染色 30 min，用1%醋酸溶液洗3遍，洗掉未與蛋白結(jié)合的染液，自然干燥后，加入150 uL 10 mM Tris堿液(pH10.5)溶解。置搖床上低速振蕩10 min后，在酶標儀上用OD490 nm波長測量各孔的吸光值。

根據(jù)吸光值計算細胞生長抑制率:細胞生長抑制率=(1-試驗組 A490/對照組 A490)×100%，實驗重復3次，應(yīng)用SPCC統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。以藥物濃度為橫坐標，細胞生長抑制率為縱坐標，繪制細胞生長抑制作用柱狀圖。

1.5 Western Blot實驗

等量的細胞總蛋白提取物，進行SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，然后進行麗春紅染色、脫色，確定轉(zhuǎn)膜成功后，脫脂奶粉封閉過夜。TBS洗滌三次后，加一抗，于37℃ 溫育2 h，TBS洗滌三次后，再加二抗，于37℃ 溫育2 h，TBS洗滌三次后進行ECL化學發(fā)光、顯影、定影。實驗以β-actin蛋白為內(nèi)參。

2 實驗結(jié)果

2.1 竹黃對L929細胞的影響

Hoechst染色后，在熒光顯微鏡下觀察:陰性對照組細胞大小均勻，邊緣清晰，細胞排列緊密，在紫外激發(fā)下可見細胞核呈均質(zhì)的藍色(圖1A，a);TNF-α(4 ng/mL)組細胞大量死亡，細胞密度急劇減小，細胞縮小，熒光顯微鏡下可見細胞核呈碎塊狀致密濃染(圖1B，b)，為典型的凋亡形態(tài);120 μg/mL竹黃組細胞變圓縮小，紫外激發(fā)可見與TNF-α(4 ng/mL)組相似的核凝縮現(xiàn)象(圖1C，c);60 μg/mL竹黃組有很多細胞濃縮變圓，但在紫外激發(fā)下，觀察到細胞核略微變小，核染色均勻(圖1D，d);30 μg/mL竹黃組(圖1E，e)已經(jīng)很難從形態(tài)學水平觀察到與陰性對照組的區(qū)別。Hoechst實驗結(jié)果顯示，通過不同濃度竹黃與L929細胞作用發(fā)現(xiàn)，高濃度竹黃可以誘導L929細胞凋亡，而當濃度為30 ng/mL時，對細胞基本無影響。這一結(jié)果有利于我們選擇合適的竹黃濃度(≤30 ng/mL)進行與 TNF-α(4 ng/mL)共同誘導實驗，以探求竹黃參與TNF-α信號網(wǎng)絡(luò)的具體作用機理。

圖1 不同濃度的竹黃作用48 h后L929細胞的形態(tài)變化(×400)Fig.1 Morphologic changes of L929 cells after treatment with different concentrations of Shiraia extracts for 48 h(×400).

2.2 竹黃雙向調(diào)節(jié)TNF-α誘導的L929細胞凋亡過程

應(yīng)用SRB實驗法，我們測量不同濃度竹黃提取物對TNF-α(4 ng/mL)誘導L929細胞凋亡這一模型的影響作用。在酶標儀上用OD490 nm波長測量各孔的吸光值，然后根據(jù)公式計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率=(1-試驗組A490/對照組A490)×100%，見表 1。

表1 不同濃度的竹黃提取物對TNF-α誘導的L929細胞的影響，n=3)Table 1 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α，n=3)

表1 不同濃度的竹黃提取物對TNF-α誘導的L929細胞的影響，n=3)Table 1 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α，n=3)

*:P ＜0.05(SPSS軟件分析).

竹黃提取物濃度(μg/ml)Concentration抑制率(%)60.77% ±0.38%15+4 ng/mLTNFα 0.281 ±0.002 49.07% ±0.38%7.5+4 ng/mLTNFα 0.311 ±0.004* 43.64% ±0.77%*3.75+4 ng/mLTNFα 0.313 ±0.005* 43.37% ±0.86%*1.88+4 ng/mLTNFα 0.329 ±0.003* 40.44% ±0.52%*0.94+4 ng/mLTNFα 0.309 ±0.002* 44.14% ±0.32%*0.47+4 ng/mLTNFα 0.291 ±0.022 47.35% ±3.97%0+4 ng/mLTNFα 0.287 ±0.006 47.99% ±1.02%0+0 ng/mLTNFα(對照組)Inhibition 30+4 ng/mLTNFα 0.217 ±0.002*吸光度A490值A(chǔ)bsorbance 0.558 ±0.005 0

以藥物濃度為橫坐標，細胞生長抑制率為縱坐標，繪制細胞生長抑制作用柱狀圖(圖2)。研究發(fā)現(xiàn)，竹黃提取物在濃度0.94 ～7.5 μg/mL 范圍內(nèi)能減小TNF-α對L929細胞的抑制作用，且當竹黃濃度在1.88 μg/mL時，抑制效果最為明顯，此時的抑制率與TNF-α(4 ng/mL)組相比下降15.8%;當濃度大于1.88 μg/mL時這種作用隨竹黃濃度的增高而逐漸減小，當濃度小于1.88 μg/mL時隨竹黃濃度的減小而減小。當竹黃提取物濃度為15 μg/mL或者0.47 μg/mL時與陽性對照組相比沒有明顯差異;而當竹黃濃度繼續(xù)增大到達30 μg/mL時抑制率與TNF-α(4 ng/mL)組相比上升26.6%。

圖2 不同濃度的竹黃提取物對TNF-α誘導的L929細胞的影響Fig.2 Effect of Shiraia extracts on L929 induced by TNF-α

2.3 竹黃對COX-2蛋白表達的影響

用Western blotting分析不同濃度的竹黃提取物通常情況下在大多數(shù)組織細胞中不表達或表達極低，受炎癥或致癌物等刺激時表達迅速上調(diào)［18］。COX-2與炎癥發(fā)生以及多種癌癥的發(fā)生都密切相關(guān)，COX-2特異性抑制劑能減輕RA病人的癥狀并緩解RA引起的慢性疼痛［19］。在本研究中，TNF-α誘導L929細胞后，細胞內(nèi)的COX-2表達量與陰性對照組比較顯著提高;30 μg/mL與15 μg/mL竹黃實驗組COX-2的表達量與TNF-α誘導組相比沒有顯著的差別，但 7.5 μg/mL 與 3.75 μg/mL 竹黃實驗組的COX-2的表達量逐漸減弱，推測竹黃可能通過降低 COX-2的表達量進而抑制 TNF-α誘導的L929細胞凋亡。

BCL-2(B-cell lymphoma-2)基因首先是在B細胞濾泡性淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)的，過表達BCL-2抑制細胞凋亡［20］。實驗結(jié)果表明，低濃度竹黃實驗組與TNF-α(4 ng/mL)組相比，BCL-2的表達量顯著增強。這一結(jié)果與細胞水平觀察到的竹黃濃度在7.5～1.88 μg/mL 范圍內(nèi)降低TNF-α 對L929 細胞抑制率的現(xiàn)象是相一致的，表明在一定濃度范圍內(nèi)竹黃通過誘導上調(diào)BCL-2的表達來提高細胞的存活率，從而抵抗TNF-α對L929細胞的凋亡作用。

NF-κB是一種常見的轉(zhuǎn)錄因子，它的活化形式是異二聚體，通常包括P65和P50兩個蛋白質(zhì)亞單位，在許多慢性炎癥疾病中的發(fā)生和發(fā)展過程中NF-κB都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，最終決定細胞命運的是 TNF-信號通路間的平衡［21，22］。在本實驗中，與陰性對照組相比，各實驗組NF-κB P65蛋白表達量均上升，說明NF-κB P65蛋白是TNF-α誘導L929細胞凋亡過程中的重要調(diào)控因子，但由于其表達量并沒有隨著抑制凋亡現(xiàn)象發(fā)生而改變，推測其可能不是竹黃干預(yù)TNF-α信號網(wǎng)絡(luò)過程中的關(guān)鍵靶標蛋白，在竹黃抑制L929細胞凋亡過程中的作用不明顯，相關(guān)分子機理需要進一步論證。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，真菌竹黃中含有藥理作用相反的活性物質(zhì)，可以雙向調(diào)節(jié)TNF-α誘導的L929細胞凋亡過程。通過深入探索其干預(yù)TNF-α信號網(wǎng)絡(luò)平衡的作用機制，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α信號通路中關(guān)鍵蛋白因子COX-2表達下降，BCL-2表達上調(diào)，而NF-κB基本沒有變化，推測COX-2和 BCL-2蛋白是竹黃拮抗細胞凋亡過程中的關(guān)鍵靶標蛋白，相關(guān)研究為臨床上竹黃發(fā)揮抗腫瘤和抗炎功效提供理論基礎(chǔ)，也為運用生物活性導向技術(shù)，結(jié)合天然藥物分離提純技術(shù)，進行竹黃相關(guān)藥物的篩選提供依據(jù)。

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