陶美華，王 磊，高曉霞，章衛(wèi)民*

1廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地廣東省微生物研究所，廣州 510070;2廣東藥學(xué)院，廣州 510006

白木香［Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg］又稱(chēng)土 沉香，屬瑞香科沉香屬植物，為我國(guó)特有的熱帶及亞熱帶常綠喬木，是我國(guó)生產(chǎn)沉香的唯一植物資源。當(dāng)白木香樹(shù)干受到損傷或刺激時(shí)會(huì)分泌一種黑色樹(shù)脂，即為沉香樹(shù)脂。沉香是一種名貴中藥，其藥用始載于《名醫(yī)別錄》，列為上品。其味辛、苦，性微溫，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘功效，用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥［1］。此外，它還是一種在亞洲廣受歡迎和廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)名貴天然香料。沉香的化學(xué)成分主要包括倍半萜類(lèi)和2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)，按結(jié)構(gòu)類(lèi)型來(lái)分，倍半萜類(lèi)有沉香呋喃類(lèi)、杜松烷類(lèi)、桉烷類(lèi)、大根香葉烷類(lèi)等［2］。目前，白木香形成沉香的機(jī)理和過(guò)程并不清楚。

不少研究顯示，沉香屬植物結(jié)香與真菌相關(guān)。自20世紀(jì)30年代，從沉香屬植物結(jié)香部位分離到的真菌有葡萄座腔菌(Botryosphaeria rhodina)、色二孢菌(Diplodia sp.)、鐮刀菌(Fusarium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、毛霉(Mucor sp.)、青霉(Penicillium sp.)、木霉(Trichoderma sp.)、裂褶菌(Schizophyllum sp.)等［3］。在本課題組的前期研究中，從白木香不同部位分離到20多株真菌［4］。人工造香實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌菌株B.rhodina A13侵染的促香效果顯著。與空白對(duì)照相比，它能使白木香快速產(chǎn)生黃褐色沉香樹(shù)脂［5］。在此基礎(chǔ)上，我們又對(duì)不同來(lái)源的白木香結(jié)香部位真菌類(lèi)群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌是結(jié)香部位的優(yōu)勢(shì)真菌。我們的研究結(jié)果和馮乃憲的基本一致，他從沉香木塊中分離到9株真菌，通過(guò)菌種對(duì)沉香組成成分芐基丙酮的耐受性實(shí)驗(yàn)、菌種接種后人工結(jié)香木材寬度、燃燒香味比較，發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌有促進(jìn)結(jié)香作用。他還對(duì)其促進(jìn)結(jié)香后精油成分進(jìn)行了GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)含有沉香倍半萜類(lèi)沉香螺旋醇以及萘酮類(lèi)、酚類(lèi)等沉香形成前體成分［6］。此外，魏建和的研究結(jié)果也證實(shí)葡萄座腔菌是一種產(chǎn)沉香的誘導(dǎo)劑［7］。

為了研究真菌對(duì)白木香形成沉香的作用機(jī)理，研究人員采用了野外植株接種實(shí)驗(yàn)［5-7］和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法［8］。野外植株接種實(shí)驗(yàn)?zāi)芊从嘲啄鞠憬Y(jié)香的真實(shí)情況，但實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，且容易受環(huán)境中土壤、害蟲(chóng)、氣候等諸多因素影響。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法條件可控，方法簡(jiǎn)單，但存在的主要問(wèn)題是與植株實(shí)驗(yàn)有差異，如研究表明在植株水平上可以在病原菌侵染部分形成局部高濃度活性氧而起一定作用，但在懸浮細(xì)胞系統(tǒng)中就不能形成這種局部效應(yīng)［9］。為此，本研究參照植物病理學(xué)文獻(xiàn)［10］，首次建立了一種離體白木香枝條實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，為研究真菌誘導(dǎo)白木香形成沉香的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

內(nèi)生真菌Botryosphaeria rhodina A13分離自白木香結(jié)香部位，保藏在廣東省微生物菌種保藏中心;新鮮白木香樹(shù)枝采自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)基地;沉香醇浸膏由廣東省信宜市珍稀沉香發(fā)展有限公司提供。

1.2 儀器

RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng);SHZ-D(II)型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng);DLSB-5/10低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;FA2004電子分析天平，上海天平儀器廠(chǎng);超凈工作臺(tái)，上海恒益科技有限公司;LRH-250-G光照培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠(chǎng);Thermo Trace DSQ型色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Finnigan公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 離體白木香枝條接種試驗(yàn)

2.1.1 菌種活化

保藏于低溫冰箱中的菌株B.rhodina A13挑取少量菌絲體接種到經(jīng)高壓滅菌的PDA斜面上，28℃培養(yǎng)7 d進(jìn)行菌種活化。

2.1.2 白木香枝條的表面消毒

將粗約0.5～1 cm的新鮮白木香枝條切成約8 cm左右的小段，先在0.1%升汞溶液中浸泡3～7 min，取出后用無(wú)菌水漂洗3～4次，再放入75%乙醇中浸泡3～7 min，無(wú)菌水漂洗3～4次，然后用滅過(guò)菌的打孔器在白木香枝條上打孔。

2.1.3 接種

將打孔后白木香枝條放入有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿上。用5 mL無(wú)菌水沖洗真菌B.rhodina A13斜面菌種，用大頭吸管吸取菌液，注入到打孔的白木香枝條上。接種后培養(yǎng)皿用保鮮膜封口，在黑暗、27℃環(huán)境中放置20 d。同時(shí)設(shè)置未接菌的新鮮白木香枝條對(duì)照組和在PDA培養(yǎng)7 d的菌株A13菌絲對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行。

2.2 樣品前處理及GC-MS分析

2.2.1 樣品前處理

將各實(shí)驗(yàn)組樣品放入三角瓶中，加入95%乙醇浸泡過(guò)夜，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，用1.5 mL氯仿溶解后過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待用。設(shè)置沉香對(duì)照組，將沉香醇浸膏用氯仿溶解并過(guò)微孔濾膜后備用。

2.2.2 GC-MS 分析

氣相色譜條件:Agilent毛細(xì)管色譜柱DB-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);色譜柱程序升溫條件:初始柱溫60℃(保持2 min)，以5℃/min升至150℃，再以1℃/min升至160℃(保持15 min)，再以8℃/min升至250℃(保持20 min);傳輸線(xiàn)溫度250℃，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量1 μL，程序升溫汽化不分流進(jìn)樣，初始溫度60℃，14.5℃/min升溫至250℃。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源，離子源溫度230℃;掃描質(zhì)量范圍(m/z)40～500。

各實(shí)驗(yàn)組組分采用NIST2002質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行定性，采用色譜峰面積歸一法進(jìn)行相對(duì)定量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 菌株A13在離體白木香樹(shù)枝上的培養(yǎng)特征

在接種后2～4 d，離體白木香樹(shù)枝打孔處長(zhǎng)出白色菌絲體。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在9～12天，菌絲布滿(mǎn)整條樹(shù)枝以及平皿上的濾紙，顏色由白色變成黑色(圖1)。

3.2 GC-MS 分析結(jié)果

圖1 菌株A13在離體白木香樹(shù)枝上的培養(yǎng)特征Fig.1 Cultural characteristic of strain A13 in Aquilaria sinensis excised twig

(菌株A13+樹(shù)枝)實(shí)驗(yàn)組的提取物采用GCMS鑒定出11個(gè)化合物，其化學(xué)成分主要是吡喃酮、脂肪酸、烷醇和萜類(lèi)，其中萜類(lèi)化合物包括2，6-二甲基，1，7-辛二烯-3-醇、異葉綠醇、葉綠醇、3，7，11-三甲基，1-月桂醇和5，9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇。沉香對(duì)照組提取物中鑒定出24個(gè)化合物，其化學(xué)成分主要是萜類(lèi)、脂肪酸和烷醇類(lèi)，其中萜類(lèi)化合物包括反-松香芹醇、雙環(huán)大根香葉烯、香橙烯、綠花白千層醇、5，9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇。樹(shù)枝對(duì)照組提取物中鑒定出8個(gè)化合物，主要是脂肪酸和烷醇類(lèi)。菌株A13對(duì)照組提取物鑒定出9個(gè)化合物，主要是炔類(lèi)、脂肪酸和烷醇類(lèi)(表1，圖2)

表1 各實(shí)驗(yàn)組GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS identification results of chemical constituents of experimental groups

樹(shù)枝對(duì)照組Excised twigs control group 4 21.70 (Z，Z)-9，12-Octadecadien-l-ol，亞麻醇 0.64 5 25.11 Bicyclo［3.3.1］nonan-2-ol，endo，雙環(huán)［3.3.1］2-壬醇 0.76 6 28.02 Carbamic acid，氨基甲酸 0.79 7 28.36 Cyclopentanemethanol，2，2-dimethyl，2-環(huán)戊烷-2-丙醇 1.23 8 28.58 Methylenecyclooctane，亞甲基環(huán)辛烷 0.53 9 28.97 2-Methyl-oct-2-enedial 0.33 10 29.30 7-Octen-2-ol，2-methyl-6-methylene，月桂烯醇 1.45 11 30.42 2(1H)-Naphthalenone，Octahydro-1-methyl，2(1H)-萘酮，八氫-1-甲基 2.01 12 39.77 5-hydroxy-4-hydroxymethyl-1-［1-hydroxyl-1-isopropyl］ cyclohex-3-ene，5-羥基-4-羥甲基-1-［1-羥基-1-異丙基］環(huán)己-3-烯 5.58 13 48.85 9，12，15-Octadecatrienoic acid，methylester，亞麻酸甲酯 1.42 14 49.67 3-tetradecanynoic acid 1.68 15 50.78 Cyclohexaneacetic acid，2-ethyl，2-環(huán)己烷丁酸 4.45 16 51.72 3-Tetradecanynoic acid，3-十四碳烯酸 4.88 17 52.49 Aromadendrene，香橙烯 5.40 18 54.34 13-Octadecenal，13-十八碳醛 9.53 19 54.48 1-Hexadecanol，1-十六烷醇 15.56 20 54.92 4-Decenoic acid，ethylester，(Z)-4-癸烯酸乙酯 1.00 21 57.23 Sulfoxide，methyl phenethyl 3.91 22 62.54 Benzeneacetic acid，phenylmethylester，苯乙酸苯甲酯 4.00 23 63.35 Viridiflorol，綠花白千層醇 0.33 24 68.915，9-Dimethyl-2-(1-methylethyldene)-1-cyclodecanol，5，9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇 0.27菌株A13對(duì)照組Strain A13 control group 1 16.08 2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl，5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-2-酮 2.94 2 42.40 Disulfide，1，1-dimethylethylethyl，二硫化合物，1，1-二甲基乙基，乙基 3.16 3 49.21 Benzenebutanoic acid，3-nitro-oxo，3-硝基-3-苯甲?；?1.93 4 50.21 Nonanoid acid，壬酸 8.88 5 50.83 Tetradecanoic acid，ethylester，肉豆蔻酸乙酯 10.82 6 54.25 Hexadecenoic acid 0.08 7 54.53 1-Hexadecanol，1-十六烷醇 37.75 8 59.74 1-Decanol，2-hexyl，2-己基-1-癸醇 3.49 1 16.23 2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl，5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-2-酮 16.02 2 23.31 1-Hepten-4-ol，1-庚烯-4-醇 3.47 3 50.50 Undecanoic acid，十一烷酸 9.03 4 50.78 Tetradecanoic acid，ethylester，肉豆蔻酸乙酯 3.65 5 53.06 1-Pentadecyne，1-十五炔 2.50 6 54.39 ［Z］，6，［Z］9-Pentadecadien-1-ol，［Z］，6，［Z］9-十五烷二烯-1-醇 8.04 7 54.49 Oleyl Alcohol，油醇 9.04 8 54.67 9-Octadecyne，9-十八炔 29.31 9 54.96 Ethyl 9-decenoate，9-癸酸乙酯3.90

圖2 實(shí)驗(yàn)組提取物的GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 GC-MS total ion chromatograms of extracts from experimental groups

4 討論

研究結(jié)果顯示，未接菌的離體白木香樹(shù)枝對(duì)照組和PDA培養(yǎng)7 d的菌株B.rhodina A13對(duì)照組提取物中未檢出萜類(lèi)化合物，而接種A13菌株的離體白木香樹(shù)枝實(shí)驗(yàn)組和沉香對(duì)照組中都有萜類(lèi)化合物，包括大根香葉烷類(lèi)倍半萜5，9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇。這說(shuō)明菌株A13能誘導(dǎo)離體白木香枝條形成沉香倍半萜類(lèi)化合物。此離體實(shí)驗(yàn)?zāi)苣M野外植株接種實(shí)驗(yàn)，在野外植株接種實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)有促進(jìn)結(jié)香作用的真菌A13在離體條件下同樣也能誘導(dǎo)沉香組分的產(chǎn)生。與野外植株實(shí)驗(yàn)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)相比，離體實(shí)驗(yàn)具有條件可控，方法簡(jiǎn)單，并且又接近白木香植物自然結(jié)香狀況等優(yōu)點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)方法可作為研究真菌誘導(dǎo)白木香形成沉香作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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