謝久祥，林恭華，都玉蓉，巨海蘭，索有瑞，張同作*

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810008;2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)研究生院，北京 100049;3青海師范大學(xué)，青海 810008;4青海省大通縣森防站，大通 810100

沙棘(Hippohae rhamnoides L.)隸屬胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬，又名黑刺、醋柳、沙棗，為落葉灌木或喬木，產(chǎn)于歐亞兩洲［1］。沙棘具有很高的藥用和食用價(jià)值，是蒙古族、藏族慣用藥材［2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，沙棘中主要活性成分為黃酮類化合物［3-5］。黃酮類化合物是一類具有重要生物活性的物質(zhì)，能顯著增加冠狀動(dòng)脈血流量，增加心肌營(yíng)養(yǎng)血流量，降低心肌耗氧量，抑制血小板聚集，對(duì)心率失常、高血脂、心肌缺血具有明顯改善效果，可預(yù)防心腦血管疾?。?-8］。

沙棘果、葉及全株都含有黃酮類等活性物質(zhì)和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［9］。沙棘葉已被開(kāi)發(fā)為配制維生素和類黃酮制劑的重要原料［10］，也被開(kāi)發(fā)為保健茶［11］、保健酒［12］和沙棘飼料［13］，俄羅斯甚至把沙棘葉作為生產(chǎn)面包的重要原料［14］。沙棘根和莖韌皮部厚實(shí)，對(duì)人類也具有潛在的藥用價(jià)值，但目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。沙棘不同部位總黃酮含量方面已有一些報(bào)道［15-18］，但涉及莖、葉的較少，其根部總黃酮含量測(cè)定還未見(jiàn)報(bào)道。

沙棘在我國(guó)南北均有分布，總面積超過(guò)2.13×104km2［19］。青海省目前擁有天然沙棘林面積 5.3萬(wàn)hm2，人工沙棘林面積7.3萬(wàn)hm2，未成林造林面積7.4萬(wàn)hm2，其后備資源豐富，發(fā)展沙棘產(chǎn)業(yè)潛力很大［20］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)青海天然沙棘根、莖和葉3個(gè)部位總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，為沙棘資源的合理開(kāi)發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器、試劑

2009年10月，于青海大通縣干溝鄉(xiāng)(海拔2927，E 101°34'10.91″，N 36°57'09.02″)采集沙棘樣品10株。

721型數(shù)顯可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華)，DU 640核酸蛋白分析儀(Beckman Coulter)HH-4恒溫水浴鍋(國(guó)華電器)，101A-2電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(天津泰斯特)，DZF-1型(6050B)真空干燥箱(上海福瑪)，ACCULAB萬(wàn)分之一電子天平(Satorius Group)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(科翔生物，純度≥98%)，無(wú)水乙醇、95%乙醇、硝酸鋁 Al(NO3)3.9H2O(100 g/L)、醋酸鉀(9.8 g/L)均為分析純(安徽安特生物化學(xué)有限公司)，實(shí)驗(yàn)水為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)原理

溶于乙醇的黃酮類化合物在弱堿性條件下，與顯色劑三價(jià)鋁離子結(jié)合生成有色物質(zhì)，可在415 nm波長(zhǎng)附近產(chǎn)生最大吸收。在一定的濃度范圍內(nèi)，其吸光度值與黃酮類化合物含量成正比。與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，可定量測(cè)定黃酮類化合物的含量［21］。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理和提取液制備

將沙棘根、莖和葉樣品經(jīng)105℃殺青、75℃干燥至恒重后，粉碎，過(guò)40目篩，準(zhǔn)確稱取粉末1.000 g，置100 mL 燒杯中，加入乙醇(95%)30 mL，燒杯置于65℃ 水浴鍋中加熱45 min，攪拌使之溶解。取出后冷卻至室溫，上清液使用快速濾紙過(guò)濾。燒杯、漏斗、濾渣及濾紙用少量乙醇(95%)洗滌至濾液無(wú)色。最后用乙醇(95%)稀釋至50 mL，搖勻，待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取經(jīng)120℃減壓真空干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液10 mL，置于50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得到蘆丁對(duì)照品使用溶液，其濃度為0.2 mg/mL。

1.3.3 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

分別移取一定的蘆丁對(duì)照品溶液，用DU 640核酸蛋白分析儀(Beckman Coulter)在300～500 nm范圍掃描，發(fā)現(xiàn)蘆丁和樣品在415 nm處均有最大吸收波長(zhǎng)，因此將415 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.4 校準(zhǔn)曲線制作

1.3.4.1 取蘆丁對(duì)照品使用溶液 0，0.50，1.00，2.50，3.75，7.5，10，12.5 mL，分別放人 25 mL 容量瓶中。

1.3.4.2 加 95% 乙醇至總體積為 7.5 mL，依次加入硝酸鋁溶液0.5 mL，醋酸鉀溶液0.5 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻。靜置1h，所得標(biāo)準(zhǔn)液濃度依次為0.004，0.008，0.02，0.03，0.06，0.08，0.10 mg/mL。

1.3.4.3 用1 cm比色皿于415 nm處，以30%乙醇為空白，測(cè)定吸光度。

1.3.4.4 以25 mL 容量瓶中蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Excell軟件計(jì)算其回歸方程。精密吸取待測(cè)試料溶液0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，按校準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行操作。以空白試液(取蘆丁對(duì)照品使用溶液0 mL)作參比，用1 cm比色皿，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)415 nm處測(cè)定試料溶液的吸光度。通過(guò)回歸方程計(jì)算，求出試料溶液中的黃酮類化合物含量(mg)。

1.3.5 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取蘆丁對(duì)照品使用溶液1 mL，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取2.2.1制備的提取溶液和上述兩標(biāo)準(zhǔn)液各l mL，每10 min測(cè)定1次吸光度，考察(60 min)，計(jì)算 RSD。

1.3.7 回收率測(cè)定

精密吸取制備的提取液5份，分別置10 mI容量瓶中，加入一定量蘆丁對(duì)照品，按測(cè)定波長(zhǎng)項(xiàng)下處理，計(jì)算平均回收率和RSD。

2 結(jié)果

2.1 波長(zhǎng)確定和校準(zhǔn)曲線繪制

2.1.1 波長(zhǎng)確定

圖1 蘆丁吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin absorbance

經(jīng)測(cè)定，在波長(zhǎng)415 nm處蘆丁對(duì)照品有最大吸收、樣品也有較大吸收，確定測(cè)定波長(zhǎng)為415 nm。

2.1.2 校準(zhǔn)曲線繪制

經(jīng)計(jì)算得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=8.3684x+0.0049，相關(guān)系數(shù) R2=0.9996，在 0.008-0.06 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖1)。

2.2 精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率試驗(yàn)結(jié)果

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為 0.040%(表1)和0.138%(表2)，平均回收率為99.05%，RSD 為1.28%(表3)。樣品的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD為1.201%(表2)。以上結(jié)果表明兩種測(cè)定方法的精密度、穩(wěn)定性良好，經(jīng)回收率試驗(yàn)證明都具有良好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，適用于蘆丁總黃酮的測(cè)定。

表1 精密度試驗(yàn)Table 1 The results of precision test

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 2 The results of stability test

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)Table 3 The results of plus sample recovery test

2.3 沙棘不同部位總黃酮含量

表4表明，沙棘根、莖和葉中總黃酮含量分別為:5.12 ±1.07 mg/g，(n=10)、11.37 ±1.89 mg/g(n=10)、95.87 ±8.62 mg/g(n=10)，各部位總黃酮含量差異顯著(n=30，P＜ 0.01)，葉中最高，根中最低。

表4 沙棘不同部位黃酮含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Content distribution of total flavonoids in different parts of sea buckthorn

3 討論

總黃酮含量的測(cè)定方式一般有分光光度法和高效液相色譜法，高效液相色譜法雖然重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等指標(biāo)均較好，但儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，費(fèi)用較高。分光光度法測(cè)定黃酮含量，不但操作簡(jiǎn)單方便，而且結(jié)果準(zhǔn)確可靠［22］。本實(shí)驗(yàn)以乙醇為提取劑，利用水浴法提取沙棘葉黃酮類化合物，以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品，在415 nm處測(cè)定吸光度，所得校準(zhǔn)曲線線性良好，穩(wěn)定性良好，精密度良好，為沙棘總黃酮含量測(cè)定的一種簡(jiǎn)便可行的方法。

本實(shí)驗(yàn)表明，沙棘是西北地區(qū)木本植物中總黃酮含量較高的植物，其含量?jī)H次于龍柏葉(197.5 mg/g)和茶樹(shù)(Camellia sinensis)葉(99.39 mg/g)［23］。青海沙棘葉片中總黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于山西沙棘(24.19 mg/g)［24］、陜西沙棘(5.40 mg/g)［16］、河北沙棘(12.98 mg/g)［25］。我們的試驗(yàn)結(jié)果和邸多隆等人關(guān)于沙棘葉總黃酮含量(65.4 mg/g)［26］的報(bào)道是一致的，都證明青海沙棘葉片中總黃酮含量在全國(guó)沙棘中處于最高水平。這是采樣地的高海拔、強(qiáng)輻射和高寒氣候造成的［27］。沙棘葉中總黃酮含量為根的18.7倍、莖中總黃酮含量約為的倍8.4，沙棘葉總黃酮開(kāi)發(fā)利用價(jià)值最高。

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