張亞茹，吳 晟，姜銀風(fēng)，叢峰松*

1上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240;2上海家化聯(lián)合股份有限公司，上海市 200082

低氘水的生物學(xué)效應(yīng)已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道。最早Somlyai等［1］報(bào)道，低氘水可以抑制小鼠成纖維L929細(xì)胞的生長(zhǎng)速率并且引起移植瘤小鼠腫瘤組織消退。俄羅斯研究人員最近［2-4］發(fā)現(xiàn)，如果把普通水中氘的體積分?jǐn)?shù)減少65%，就會(huì)表現(xiàn)出一定的抗腫瘤特性，抑制瘤小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，低氘水能抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠存活期。叢峰松［5］等報(bào)道，低氘水可以抑制肺癌移植瘤小鼠瘤體的生長(zhǎng)。本文擬通過實(shí)驗(yàn)研究低氘水對(duì)正常皮膚成纖維細(xì)胞增殖、乳酸代謝以及對(duì)黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑色素生成等方面的影響，并研究低氘水對(duì)紫外輻射后受損細(xì)胞的修復(fù)作用，初步探討低氘水在化妝品方面的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

CCD-1095sk細(xì)胞和B16黑色素瘤細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫。低氘水(DDW)由上海池天超輕水生物工程有限公司提供，氘含量分別為25，50和105 ppm;Hyclone血清購自賽莫飛世爾生物制品有限公司;MTT試劑盒購自南京凱基生物有限公司;LD檢測(cè)試劑盒購自南京建成;MEM，RPM1640培養(yǎng)基粉劑購自GIBCO公司。酪氨酸酶(25KU)購自Worthington公司，L-Dopa購自SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常皮膚細(xì)胞株CCD-1095sk培養(yǎng)在含10%進(jìn)口胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。B16黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 法測(cè)定 CCD-1095sk 細(xì)胞增殖

CCD-1095sk細(xì)胞(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)接種于含100 μL培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中，對(duì)照組用正常MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別用25、50和105 ppm的低氘水配制的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，處理8、10、12、24和48 h后，加入50 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈培養(yǎng)液后，每孔加 150 μL DMSO，振蕩 10 min，在490 nm波長(zhǎng)條件下，測(cè)定各孔的吸光度OD值。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 LD試劑盒測(cè)定CCD-1095sk細(xì)胞乳酸代謝

收集對(duì)數(shù)期CCD-1095sk細(xì)胞，懸浮，分別取等量細(xì)胞懸液至于用25，50和105 ppm的低氘水配置的MEM培養(yǎng)基中，在8、10、24和48h檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞代謝的乳酸含量。每組設(shè)三個(gè)平行對(duì)照。

乳酸(LD)含量=(測(cè)定管吸光度值-空白管吸光度值)÷(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值-空白光吸光度值)×標(biāo)準(zhǔn)濃度(3 mmol/l)×樣本稀釋倍數(shù)

1.2.4 體外酪氨酸酶活性測(cè)定［6，7］

根據(jù)酪氨酸活性測(cè)定參考文獻(xiàn)，在3 ml反應(yīng)體系中，含有 0.05 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.8)，以0.5 mmol/L L-DOPA作為測(cè)活底物，酪氨酸酶的終濃度為15.29 μg/mL。用分光光度計(jì)檢測(cè)475 nm波長(zhǎng)處的光密度值隨著反應(yīng)時(shí)間的變化，從直線部分的斜率換算出酶活力，消光系數(shù)ε為3700(mol/L·cm)-1。

1.2.5 細(xì)胞酪氨酸酶活性測(cè)定［8-10］

分別用 25、50和105 ppm的低氘水配置的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)B16細(xì)胞，72 h后，棄上清。用pH 7.4的PBS洗滌細(xì)胞2次。每孔加10 ml/L的TrionX-100溶液90 μL，震蕩5 min溶解細(xì)胞。經(jīng)37℃溫浴后，每空加1%L-Dopa 10 μL，繼續(xù)孵育30 min，于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。每組設(shè)五個(gè)復(fù)孔。

酪氨酸酶活性抑制率=(1-各濃度平均吸光度值÷對(duì)照組平均吸光度值)×100%

1.2.6 黑色素含量測(cè)定［10，11］

采用改良的Hideya Ando方法，用不同濃度的低氘水培養(yǎng)B16細(xì)胞72 h后，調(diào)整細(xì)胞濃度至105個(gè)/mL。吸取細(xì)胞懸液分別置于離心管中，離心棄上清。用200 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞沉淀后，加入1 mL 1∶1乙醇乙醚液，在室溫下放置30 min。3000 rpm離心5 min后棄上清。加入1 mL含10%DMSO的 1mol/L NaOH溶液，80℃水浴45 min后于470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。每組設(shè)三個(gè)平行對(duì)照。

黑色素合成抑制率=［1-(藥物孔吸光度值÷藥物孔細(xì)胞密度)÷(對(duì)照孔吸光值÷對(duì)照孔細(xì)胞密度)］×100%

1.2.7 紫外損傷實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)期CCD-1095sk細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為105個(gè)/mL。1(104個(gè)細(xì)胞/孔接種于含100 μL培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中，分別用25、50和105 ppm的低氘水配置的MEM培養(yǎng)基及正常MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，進(jìn)行紫外照射。照射條件:UVC燈管功率15 W，波長(zhǎng)254 nm，垂直照射距離20 cm，照射時(shí)間2 h。然后繼續(xù)培養(yǎng)8 h，用MTT檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況。以不照射的細(xì)胞作為陽性對(duì)照組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均以means±SD表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 低氘水對(duì)正常皮膚成纖維細(xì)胞CCD-1095sk的影響

用不同濃度的低氘水培養(yǎng)CCD-1095sk細(xì)胞，在培養(yǎng)的初期，低氘水表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。在8 h時(shí)，25 ppm和50 ppm的低氘水作用的細(xì)胞增殖率分別為102.27%和104.09%，與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，如圖1A，1B所示。在10 h時(shí)，25 ppm的低氘水作用的細(xì)胞增殖率為104.75%，與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)，P＜0.05。當(dāng)培養(yǎng)至12 h以后，用低氘水培養(yǎng)的細(xì)胞逐漸開始出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)至48 h時(shí)，低氘水又開始促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。其中，105 ppm的低氘水作用最為明顯，增殖率為103.66%，與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，如圖1C所示。

圖1 不同濃度的低氘水對(duì)正常皮膚成纖維CCD-1095sk細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of DDW on the proliferation of CCD-1095sk cells.A:25 ppm DDW;B:50 ppm DDW;C:105 ppm DDW.*:P ＜0.05，vs control

2.2 低氘水對(duì)細(xì)胞CCD-1095sk細(xì)胞乳酸生成的影響

用不用濃度的低氘水培養(yǎng)CCD-1095sk細(xì)胞，取上清培養(yǎng)液檢測(cè)細(xì)胞代謝的乳酸(LD)的含量。結(jié)果顯示，培養(yǎng)至10 h時(shí)，用50 ppm和105 ppm的低氘水培養(yǎng)的細(xì)胞液中乳酸產(chǎn)量明顯低于正常對(duì)照組，乳酸產(chǎn)率分別為正常組的68.47%和85.87%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。培養(yǎng)至48 h時(shí)，用25 ppm和50 ppm的低氘水作用的CCD-1095sk細(xì)胞液中，乳酸產(chǎn)率分別為正常組的 81.22%和82.64%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，如圖2所示。實(shí)際乳酸的含量見表1。

圖2 不同濃度的低氘水對(duì)CCD-1095sk細(xì)胞LD生成的影響Fig.2 DDW affects contents of LD of CCD-1095sk cells.

表1 CCD-1095sk細(xì)胞LD含量(mmol/L)Table 1 LD content of CCD-1095sk cell(mmol/L)

2.3 DDW對(duì)酪氨酸酶活性的影響

在體外生化反應(yīng)體系中，25 ppm與105 ppm的低氘水對(duì)酪氨酸酶活力抑制率為3.67%，50 ppm的低氘水對(duì)酪氨酸酶活力抑制率為11.89%，如Fig 3所示。

圖3 不同濃度的低氘水對(duì)酪氨酸酶活性的影響Fig.3 Effects of DDW on tyrosinase activity.

2.4 DDW對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

用不同濃度的低氘水作用B16黑色素瘤細(xì)胞72 h后，以L-DOPA作為測(cè)活底物，檢測(cè)細(xì)胞中酪氨酸酶的活性。50 ppm和105 ppm的低氘水對(duì)酪氨酸酶的抑制率分別達(dá)到44.32%和24.51%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.05，F(xiàn)ig 4。

圖4 不同濃度的低氘水對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響Fig.4 Effects of DDW on tyrosinase activity in B16 cells.

2.5 低氘水對(duì)B16細(xì)胞黑色素生成的影響

用不同濃度的低氘水作用B16黑色素瘤細(xì)胞72 h后，50 ppm的低氘水對(duì)B16細(xì)胞的黑色素生成的抑制率為39.59%，25 ppm和105 ppm低氘水對(duì)B16細(xì)胞的黑色素生成的抑制率分別為26.45%和24.61%，與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，如 Fig 5 所示。

圖5 不同濃度的低氘水對(duì)B16細(xì)胞黑色素生成的影響Fig.5 Effects of DDW on melanogenesis.

2.6 低氘水對(duì)受到紫外損傷細(xì)胞的修復(fù)作用

與陽性對(duì)照組相比較，經(jīng)紫外照射的細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞增殖降低了30.43%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，說明紫外損傷的模型是成功的(陽性對(duì)照組細(xì)胞不經(jīng)過紫外照射)。用不同濃度的低氘水作用經(jīng)紫外照射的CCD-1095sk細(xì)胞，結(jié)果顯示，用50 ppm的低氘水培養(yǎng)的細(xì)胞增殖率為105.37%，與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.05，如圖6所示。

圖6 低氘水對(duì)紫外損傷細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effects of DDW on cell proliferation after irradiation of UVC

3 結(jié)論

現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用給化妝品行業(yè)帶來全新的發(fā)展機(jī)遇，化妝品已從潔膚，潤(rùn)膚為目的的基礎(chǔ)護(hù)膚品向延緩衰老，美化膚色為目的的功效性化妝品方向發(fā)展［12］。人們對(duì)化妝品的關(guān)注已經(jīng)不再是單純的美麗動(dòng)人，而是轉(zhuǎn)向其安全性。普通水中，氘和氕的比率(D/H)大約是1∶6600，即水中氘的體積分?jǐn)?shù)為0.015%［13］。我們把氘體積分?jǐn)?shù)低于0.015%的水稱為低氘水(deuterium-depleted water，DDW)。氘和氕由于質(zhì)量不同導(dǎo)致氫的這兩種穩(wěn)定同位素之間物理和化學(xué)性質(zhì)的不同［14，15］。

皮膚的彈性、光滑等外觀一定程度上由構(gòu)成皮膚不同組分的細(xì)胞的增殖和分裂所決定［16］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在細(xì)胞培養(yǎng)的初期，不同濃度的低氘水均表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞增殖活力，同時(shí)細(xì)胞中乳酸的產(chǎn)量減少。

皮膚色調(diào)的主要因素是皮膚內(nèi)的黑色素，膚色的深淺主要決定于黑色素細(xì)胞合成黑色素的能力［16］。酪氨酸酶 (tyrosinase)俗稱多酚氧化酶，普遍存在于人和動(dòng)植物體內(nèi)，是黑色素生物合成過程中必不可少的關(guān)鍵酶。它能將L-多巴氧化成多巴醌，多巴醌不穩(wěn)定，可以經(jīng)一系列的非酶促反應(yīng)后，形成由5，6-二羥吲哚和 5，6-二羥吲哚-2-羧酸單元構(gòu)成的異聚體-黑色素［17］。如果該酶活力過高，可形成黑色素瘤，因此引起了人們對(duì)酪氨酸酶的關(guān)注。體外生化實(shí)驗(yàn)表明，三種不同濃度的低氘水能不同程度地抑制酪氨酸酶活性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，50 ppm和105 ppm的低氘水能顯著抑制B16細(xì)胞的酪氨酸酶活性，降低細(xì)胞黑色素生成量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.05。

隨著臭氧層破壞的加重，到達(dá)地球表面的紫外線日益增多。紫外線輻射(UVR)會(huì)導(dǎo)致皮膚細(xì)胞的活性氧(ROS)增加，引起DNA和角膜損傷，促進(jìn)皮膚光老化和癌變以及白內(nèi)障、免疫抑制等疾病的發(fā)生［18-20］。Bild 等［21］人用 30 ppm 的低氘水喂養(yǎng)小鼠15天，然后用8.5 Gray的半致死量射線進(jìn)行照射。對(duì)照組小鼠用普通水喂養(yǎng)，用同樣劑量的射線照射。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的小鼠存活率為61%，而對(duì)照組小鼠的存活率僅有25%。我們實(shí)驗(yàn)也證實(shí):50 ppm的低氘水能促進(jìn)受到紫外損傷的CCD-1095sk成纖維細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，與正常對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。以上結(jié)果提示，低氘水對(duì)細(xì)胞DNA損傷具有一定修復(fù)作用，但其具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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