何曉英 付 華 袁 平 譚 華 李小剛

瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1 神經(jīng)內(nèi)科 2 乳腺外科，四川省瀘州市 646000

粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G－CSF）是細(xì)胞因子家族中的一員，國內(nèi)外研究證實(shí)G－CSF在缺血性腦血管病中通過促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)、血管再生、抗炎等作用減輕腦損害。G－CSF對ICH是否也有神經(jīng)保護(hù)作用國內(nèi)外鮮見報(bào)道，本研究利用動(dòng)物模型研究G－CSF對ICH后腦水腫的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重250～320g，144只，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物與試劑：人重組粒細(xì)胞集落刺激因子注射液（rh G－CSF，商品名瑞血新），購自深圳新鵬生物工程有限公司；M MP－9單克隆抗體，購自Santa Cruz公司（兔抗鼠）；二抗（羊抗兔Ig G）、SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器：WDT－V型鼠腦立體定向儀（西安西北光電儀器廠）；萬分之一克電子分析天平（德國Sartorius公司生產(chǎn)）；電熱恒溫烤箱（上?？莆鰧?shí)驗(yàn)儀器廠）；通用手術(shù)器械；50μL微量進(jìn)樣器。

1.2 方法

1.2.1 分組與用藥：大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、治療組，各組均為48只。每組根據(jù)取材時(shí)間點(diǎn)又分為6h、12h、24h、48h、72h、7d組，每組8只。用藥：治療組于造模1h后腹腔注射rh G－CSF 60μg／kg，假手術(shù)組、模型組僅經(jīng)注射點(diǎn)注入等容積的生理鹽水。3組動(dòng)物于術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h、7d時(shí)間點(diǎn)被處死。

1.2.2 ICH 模型制備：參照 Yang［1］的方法制備ICH模型。大鼠稱重后予2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（50mg／kg），待完全麻醉后，俯臥固定于鼠腦立體定位儀上。常規(guī)頭皮消毒，沿頭皮正中切開一長約10mm縱切口，切開骨膜，鈍性分離暴露前囟，調(diào)整立體定位儀，將微量注射儀尖端定位于前囟前0.5mm，中線右側(cè)旁開3mm處，用微型手鉆在此處鉆一直徑0.5mm的小孔。采用斷尾取自體血法取鼠尾不凝血50μL，沿所鉆小孔進(jìn)針6mm（相當(dāng)于大鼠殼尾核部位），以10μL／min速度緩慢勻速注入殼尾核，注血結(jié)束后留針15min，緩慢退針（30s），縫合頭皮。假手術(shù)組以生理鹽水50μL代替自體血，余操作同上。手術(shù)過程嚴(yán)格無菌操作。術(shù)后動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持室溫26℃。

1.2.3 干濕重法測定腦組織含水量：3組動(dòng)物于術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h、7d（n＝4）處死，開顱取出腦組織，去除腦膜、低位腦干和小腦，置于稱重杯中用電子天平稱取濕重，后置于電熱恒溫烤箱內(nèi)100℃烘烤24h，至恒重后稱干重（兩次干重之差≤0.2mg）。按Elliott公式計(jì)算：腦組織含水量（%）＝（濕重－干重）／濕重×100%。

1.2.4 M MP－9免疫組化檢測及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：3組動(dòng)物于術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h、7d（n＝4）采用4%多聚甲醛內(nèi)固定后斷頭取腦，多聚甲醛外固定，軟石蠟包埋制成蠟塊，自動(dòng)切片機(jī)連續(xù)切片，片厚5μm，用于免疫組化檢測。M MP－9免疫組化按ABC試劑盒說明書進(jìn)行。各組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)每只大鼠每個(gè)指標(biāo)選一張腦切片，在400倍光鏡下隨機(jī)選擇血腫周圍4個(gè)互不重疊的視野，每個(gè)時(shí)點(diǎn)共計(jì)16個(gè)視野，胞漿棕黃色者為陽性細(xì)胞。用IPP（image－p roplus 6.0）醫(yī)學(xué)圖像分析軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野該指標(biāo)的陽性細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)為各時(shí)點(diǎn)該指標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA）的最小顯著差法（LSD），兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。顯著性水準(zhǔn)取α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量動(dòng)態(tài)觀察 模型組腦組織含水量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），在48h、72h最明顯，且與6h、12h、24h、7d相比有差異（P＜0.05），提示ICH后腦組織含水量增加，48～72h達(dá)高峰。治療組腦組織含水量明顯低于模型組（P＜0.05），提示CSF能減輕ICH大鼠腦水腫程度。見表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量變化（±s，%）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量變化（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較＃P＜0.05；與模型組6h、12h、24h、7d比較▲P＜0.05；與模型組比較■P＜0.05。

7d假手術(shù)組 77.80±0.483 77.91±0.830 77.54±0.621 77.28±0.532 77.55±0.260組別 6h 12h 24h 48h 72h 78.02±0.571模型組 80.10±0.180＃ 81.30±0.602＃ 82.47±0.101＃ 84.15±0.581＃▲ 84.10±0.510?！?80.39±0.393＃治療組 78.03±0.112■ 78.60±0.518■ 79.02±0.910■ 80.87±0.251■ 79.73±0.272■ 78.12±0.384■

2.2 M MP－9表達(dá)的測定 模型組 M MP－9的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），模型組 M MP－9在48h、72h最明顯，且與6h、12h、24h、7d相比有差異（P＜0.05），提示ICH 后 M MP－9表達(dá)增強(qiáng)，48～72h達(dá)高峰。治療組各時(shí)間點(diǎn) M MP－9的表達(dá)低于模型組（P＜0.05），提示 G－CSF能抑制ICH 后M MP－9的表達(dá)。見表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍MMP－9表達(dá)（±s）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍MMP－9表達(dá)（±s）

注：與假手術(shù)組比較＃P＜0.05；與模型組6h、12h、24h、7d比較▲P＜0.05；與模型組比較■P＜0.05。

7d假手術(shù)組 1.35±0.88 1.50±0.87 1.45±0.83 1.65±0.82 1.60±0.74組別 6h 12h 24h 48h 72h 1.55±0.81模型組 6.35±0.87＃ 7.32±0.10＃ 8.20±0.85＃ 10.35±0.60＃▲ 10.55±0.82?！?3.70±0.38＃治療組 3.32±0.20■ 4.01±0.43■ 5.54±0.11■ 6.83±0.25■ 6.80±0.45■ 2.85±0.01■

3 討論

G－CSF作為細(xì)胞生長因子家族中的一員，是骨髓造血干細(xì)胞強(qiáng)有力的動(dòng)員劑，己廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病如中性粒細(xì)胞減少癥、骨髓移植等。近年來G－CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞治療急性心肌梗死的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究己初顯成效［2］，同時(shí)也有越來越多的研究結(jié)果顯示G－CSF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有更重要的非造血功能，因此G－CSF在神經(jīng)系統(tǒng)的作用逐漸受到關(guān)注。研究證明G－CSF的生物學(xué)作用是通過與效應(yīng)細(xì)胞表面特異性受體G－CSF－R結(jié)合而產(chǎn)生的，G－CSF－R在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有表達(dá)，這暗示G－CSF可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)攝作用而通過完整的血腦屏障［3］。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦炎（EAE）中已證實(shí)G－CSF有抗炎作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及部分臨床數(shù)據(jù)表明G－CSF通過減小腦梗死體積、抗炎、抗凋亡、促進(jìn)梗死區(qū)新的神經(jīng)和血管的形成、促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì) 胞 分 化 等 多 種 途 徑 起 到 神 經(jīng) 保 護(hù) 作 用［4，5］。Sevimli［6］等利用基因沉默技術(shù)比較了內(nèi)源性G－CSF缺乏及G－CSF替代治療的腦缺血大鼠，發(fā)現(xiàn)后者梗死病灶大小較前者顯著縮小、神經(jīng)功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于前者，進(jìn)一步證實(shí)了G－CSF參與了腦損害后神經(jīng)恢復(fù)機(jī)制。

G－CSF在ICH中的作用目前尚處于起步階段。Park等［7］觀察到在ICH模型中G－CSF能減少腦水腫范圍、減低血腦屏障通透性、減輕炎癥、減少血腫周圍死亡細(xì)胞。張磊等［8］在實(shí)驗(yàn)中也觀察到經(jīng)GCSF治療后出血灶所在的大腦半球神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。本實(shí)驗(yàn)采用斷尾取自體血方法制備ICH模型，研究顯示ICH組腦組織含水量與對照組間差別有顯著性意義，48～72h達(dá)高峰，至第7天逐漸恢復(fù)，與國內(nèi)外報(bào)道的ICH后腦水腫規(guī)律一致。同時(shí)在研究中發(fā)現(xiàn)治療組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量明顯輕于模型組（P＜0.05），提示 G－CSF能減輕ICH后腦水腫程度。

上述結(jié)果顯示ICH后，G－CSF通過減輕腦水腫程度發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，由此筆者進(jìn)一步研究了其作用的可能機(jī)制。已知腦水腫是ICH最為嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷，它的產(chǎn)生和發(fā)展是導(dǎo)致ICH病情發(fā)展和惡化的重要原因之一。ICH后腦水腫的發(fā)生發(fā)展受諸多因素影響，如：血腫成分及分解產(chǎn)物、炎性細(xì)胞因子、補(bǔ)體系統(tǒng)、M MP、AQP等，其中 M MP－9對腦水腫的影響備受關(guān)注。M MP－9是ICH后腦組織主要表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶，它可以結(jié)合基底膜的大分子物質(zhì)并破壞明膠，主要攻擊腦血管周圍基膜的主要成分，破壞血腦屏障，從而引起其通透性升高，導(dǎo) 致 腦 水 腫。Gursoy－ozde 等［9］運(yùn) 用 敲 除 了M MP－9基因的遺傳工程小鼠，證實(shí)了M MP－9可以破壞BBB和加快腦水腫形成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［10］ICH后血腫周圍M MP－9陽性細(xì)胞表達(dá)和腦組織含水量表達(dá)趨勢相同。臨床患者核磁共振研究進(jìn)一步證實(shí)患者腦水腫的變化規(guī)律與血清M MP－9表達(dá)變化過程一致［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示ICH組從6h開始M MP－9陽性細(xì)胞表達(dá)增多，48～72h達(dá)高峰，到7d還有表達(dá)，ICH組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與假手術(shù)組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且實(shí)驗(yàn)中也觀察到在模型組中M MP－9的表達(dá)趨勢同腦組織含水量的變化規(guī)律一致。治療組各時(shí)間M MP－9表達(dá)明顯輕于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示G－CSF抑制了M MP－9的表達(dá)。由此推測G－CSF減輕治療組腦水腫的機(jī)理可能與G－CSF下調(diào) M MP－9的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Sevimli［12］最近報(bào)道 G－CSF發(fā)揮腦保護(hù)作用的重要機(jī)制之一是通過下調(diào)中風(fēng)后腦組織周圍M MP－9表達(dá)相一致。G－CSF下調(diào)ICH后M MP－9表達(dá)減輕腦水腫機(jī)理推測可能是：G－CSF具有抗炎、抑制炎性細(xì)胞浸潤作用［13］，而 M MP－9主要由炎性細(xì)胞如T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞分泌，因此ICH后G－CSF通過抑制炎性因子表達(dá)下調(diào)M MP－9基因啟動(dòng)子，從而發(fā)揮減輕腦水腫程度的作用。

綜上，G－CSF具有抑制ICH周圍組織 M MP－9的表達(dá)、減輕ICH后腦水腫的作用，其確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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