張士康陸 晨朱科學(xué)王 彬朱躍進(jìn)張海華周惠明

(1.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

茶渣蛋白理化特性研究

張士康1陸 晨2朱科學(xué)2王 彬1朱躍進(jìn)1張海華1周惠明2

(1.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

對(duì)堿提制備的茶渣蛋白的氨基酸構(gòu)成、分子量分布和蛋白體外消化性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：茶渣蛋白中氨基酸種類豐富，其中必需氨基酸含量均高于FAO/WHO/UNU1985年的推薦值；茶渣蛋白SDSPAGE分子量分布呈現(xiàn)四條主要條帶，對(duì)應(yīng)分子量分別為40.54kDa、30.77kDa、24.09kDa和20.04kDa；茶渣蛋白的體外消化性比大豆蛋白低20%。

茶渣蛋白 氨基酸組成 SDS-PAGE 分子量 體外消化性

我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2011年茶葉年總產(chǎn)量達(dá)到162萬(wàn)噸[1]，比上一年增產(chǎn)9.9%，為世界第一產(chǎn)茶大國(guó)；2000年至2011年間，茶葉產(chǎn)量從71.93萬(wàn)噸增長(zhǎng)至162萬(wàn)噸，占世界總產(chǎn)量的三分之一，年均增長(zhǎng)率接近8%。隨著我國(guó)茶葉產(chǎn)量的增加和深加工的開(kāi)展，每年產(chǎn)生大量的低檔茶、茶梗以及數(shù)萬(wàn)噸的茶渣等[2]，這些茶資源都被當(dāng)做廢物扔掉，不僅會(huì)污染環(huán)境，而且也造成巨大浪費(fèi)。

茶葉是由 3.5%～7.0%的無(wú)機(jī)物和 93%～96.5%的有機(jī)物組成的，有機(jī)化合物主要有蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物、氨基酸、生物堿、茶多酚、色素、皂苷、甾醇等[3]。其中蛋白質(zhì)約占茶葉干重的20%～30%，主要是難溶的谷蛋白（82.05%）和醇溶蛋白（13.61%）；此外，還含有少量可溶的白蛋白（3.47%）和球蛋白（0.87%）[4]。茶渣蛋白主要是由難溶的谷蛋白和醇溶蛋白構(gòu)成，國(guó)內(nèi)外對(duì)于茶渣蛋白的研究多集中在提取制備上[5-7]，對(duì)于茶渣蛋白的理化性質(zhì)等深層次的信息還缺少研究和認(rèn)識(shí)。

茶渣是茶葉深加工的主要伴隨物，產(chǎn)量巨大，棄之可惜，如何利用茶渣是當(dāng)前茶產(chǎn)業(yè)面臨的一大難題。茶渣蛋白占茶渣干物質(zhì)總量的20%～30%，是茶渣的重要組成成分，開(kāi)展茶渣蛋白的研究工作是解決茶渣高效再利用問(wèn)題的一條重要途徑之一。因此，基于我國(guó)茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，結(jié)合前人的茶葉化學(xué)成分分析結(jié)果，本文擬對(duì)茶渣蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，一方面拓寬對(duì)茶渣蛋白的認(rèn)識(shí)，另一方面為解決茶渣蛋白尤其是茶渣的利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

茶渣，采自浙江塔塔科技有限公司大生產(chǎn)樣品；標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，中國(guó)上海Sigma公司。

考馬斯亮藍(lán)、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、Tris、雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、N,N,N',N'-四甲基乙二胺，北京索萊寶試劑有限公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

1100型氨基酸自動(dòng)分析儀，美國(guó)安捷倫公司；HD-3紫外線檢測(cè)儀，上海滬西分析儀器廠；DHL-A電腦恒流泵，上海滬西分析儀器廠；DYY-Ⅲ23A型電泳槽，北京市六一儀器廠；ECP300三恒多用電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶渣蛋白提取工藝

采用響應(yīng)面優(yōu)化的超聲波輔助提取茶渣蛋白[8]的方法對(duì)茶渣蛋白進(jìn)行制備。

1.2.2 茶渣蛋白氨基酸組成測(cè)定分析與評(píng)價(jià)方法

將準(zhǔn)確稱取的茶渣蛋白樣品裝于10mL安培水解管中，立即加入5mL左右的6mol/L的鹽酸溶液對(duì)茶渣蛋白進(jìn)行充分的酸水解，然后沖氮?dú)夥夤埽?10℃條件下水解24h以上，切開(kāi)封管，水解液洗滌定容并抽干后，用鄰苯二甲醛OPA柱前自動(dòng)衍生，在Agilent1100液相色譜儀上進(jìn)行氨基酸組成分析測(cè)定。

色氨酸測(cè)定采用6mol/L氫氧化鈉水解的方法，110℃水解20h后，進(jìn)行洗滌定容、中和、抽干后采用鄰苯二甲醛OPA進(jìn)行柱前自動(dòng)衍生，上Agilent1100液相色譜儀進(jìn)行分析測(cè)定。

1.2.3 SDS-PAGE凝膠電泳分析茶渣蛋白分子量分布

采用Leammli系統(tǒng)進(jìn)行茶渣蛋白分子量分布的測(cè)定。

儲(chǔ)存液配置：

A：稱取29.2g丙烯酰胺和0.8g甲叉丙烯酰胺，用水溶解并定容至100mL，過(guò)濾后在4℃保存。

B：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8，稱取18.15gTris，用60mL蒸餾水溶解，再用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH8.8，然后定容至100mL，4℃保存。

C：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8，稱取6g Tris，用60mL重蒸水溶解，再用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至pH6.8，然后定容到100mL，4℃保存。

D：10%SDS，將10g SDS溶解于80mL重蒸水中，輕輕攪拌溶解，定容至100mL，室溫存放。

E：樣品緩沖液：分別量取重蒸水4mL，0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8緩沖溶液 1.0mL，甘油0.8mL，10%的SDS1.6mL，巰基乙醇0.4mL，0.1%的溴酚藍(lán)0.2mL，總體積為8mL，加樣之前將樣品與緩沖液以1:4的比例混合后在沸水浴中加熱4min。

F：濃縮電泳緩沖溶液：稱取15g Tris，72g甘氨酸，5g SDS，用水溶解至1000mL，用時(shí)稀釋5倍。

分離膠濃度10%，濃縮膠濃度4%，穩(wěn)壓穩(wěn)流，濃縮膠階段采用10mA電流，分離膠階段采用20mA電流，電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。 同時(shí)采用 Lysozyme(14.4kDa)、Trypsin inhibitor(20.1kDa)、Carbonic Anhydrase(31kDa)、Actin (43kDa)、BSA (66.2kDa)、Phosphorylase B (97.4kDa)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用溴酚藍(lán)為指示劑，定義其遷移率為1.0，計(jì)算茶渣蛋白各條帶的相對(duì)遷移率，根據(jù)茶渣蛋白各組分的遷移率在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量分布。

1.2.4 茶渣蛋白質(zhì)的體外消化性測(cè)定

準(zhǔn)確稱取經(jīng)過(guò)初步純化的茶渣蛋白樣品0.5g，用20mL pH1.0的HCl溶液溶解，置于恒溫水浴中保溫，37℃時(shí)，加入 20mg胃蛋白酶（1: 3000），準(zhǔn)確反應(yīng)3h后，加入等體積的20%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，靜置10min，3000r/min離心分離20min，同時(shí)做空白對(duì)照。上清液中氮含量扣除空白對(duì)照中的氮含量后占樣品總氮含量的百分比即為體外消化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶渣蛋白氨基酸組成分析

表1為茶渣蛋白的氨基酸組成分析結(jié)果。由表1可以看出，茶渣蛋白中氨基酸組成齊全，八種必需氨基酸均含有；谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的含量最高，分別達(dá)到了12.27g/100g、9.24g/100g和10.22g/100g；苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸等含量都明顯高于FAO/WHO/ UNU1985年的推薦值[9]。

表1 茶渣蛋白的氨基酸組成（單位：g/100g蛋白質(zhì)）Table1 The amino acids composition of tea residue protein(g/100g protein)

2.2 茶渣蛋白分子量測(cè)定

由圖1可以看出，茶渣蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜中，共有四條譜帶，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量與遷移率的關(guān)系，這四條區(qū)帶的蛋白質(zhì)的分子量從大到小分別是：40.54kDa、30.77kDa、24.09kDa和20.04kDa。

圖1 茶渣蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of tea residue protein

2.3 茶渣蛋白體外消化性

可消化性是衡量一種蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一，本實(shí)驗(yàn)利用體外法測(cè)定茶渣蛋白的消化率的高低，并與大豆?jié)饪s蛋白相比較，結(jié)果圖2所示。

圖2 茶渣蛋白與大豆?jié)饪s蛋白體外消化率比較Fig.2 The in vitro digestion of tea residue protein and soybean protein

由圖2可知，茶渣蛋白體外消化率雖在60%以上，但與大豆?jié)饪s蛋白相比，仍然低于大豆?jié)饪s蛋白的體外消化率，這是否茶渣蛋白結(jié)合了較多的茶多酚等機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

茶渣蛋白是一種氨基酸構(gòu)成優(yōu)質(zhì)的蛋白，其分子量在SDS-PAGE中呈四條主要條帶分布，體外消化性略低于大豆蛋白。綜合來(lái)看，茶渣蛋白若作開(kāi)發(fā)為營(yíng)養(yǎng)食品可能會(huì)受到其消化性的限制，對(duì)于茶渣蛋白的成功利用還需開(kāi)展大量深度研究工作。

[1] 中華人民共和國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局.中華人民共和國(guó)2011年國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào)[R/OL].(2012-02-22)[2012-05-15]. http://www.stats.gov.cn/tjgb/ndtjgb/qgndtjgb/t20120222_ 402786440.htm.

[2] 羅紅玉,黎星輝,郁軍.茶渣回收利用研究現(xiàn)狀[J].福建茶葉, 2010,32(7):8-12.

[3] 顧謙,陸錦時(shí),葉寶存.茶葉化學(xué)[M].合肥:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社,2002.

[4] 胡曉倩,楊代群.茶葉蛋白的研究現(xiàn)狀分析及發(fā)展對(duì)策[J].資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng),2010,26(1):4-6.

[5] 陸晨,張士康,朱科學(xué),等.堿提酸沉法提取茶葉蛋白質(zhì)的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2011,27(6):673-677.

[6] 張曉輝,章克昌,活潑,等.非水溶性茶蛋白的提取工藝研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2005,26(3):64-67.

[7] 李鵑,活潑,楊海燕.茶葉中非水溶性蛋白質(zhì)提取工藝及功能性質(zhì)的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,2:150-153.

[8] 陸晨,鄒雨虹,張士康,等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取茶渣蛋白的工藝條件[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,31(3):319-325.

[9] FAO/WHO/UNU.Energy and protein requirements:Report of a jointFAO/WHO/UNU expertconsultation (World Health Organization technicalreportseries724)[R].Geneva:World Health Organization,1985:121-123.

Physiochemical Properties of Tea Residue Protein

ZHANG Shi-kang1,LU Chen2,ZHU Ke-xue2,WANG Bin,ZHU Yue-jin1,ZHANG Hai-hua1, ZHOU Hui-ming2
(1.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China;2.School of Food Science and Technology, Jiangnan Univerity,Wuxi 214122,China)

Amino acid composition of tea residue protein produced by alkali extraction was analyzed,and the result shows that amino acids varieties are various in tea residue protein and the essential amino acid contents are higher than the value of FAO/WHO/UNU1985 Recommendation.The SDS-PAGE result indicates that there are four main bands with molecular weights of 40.54kDa、30.77kDa、24.09kD and 20.04kDa,respectively.The in vitro digestion results demonstrates that the tea residue protein has lower digestibility than soybean protein by 20%。

Tea residue protein,Amino acid composition,SDS-PAGE,Molecular weight,in vitro digestion

中國(guó)茶葉加工 2012，（2）38～40

2012-05-19

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2010C32053）

張士康（1965-），男，江蘇南京人，工學(xué)博士，高級(jí)工程師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事茶資源跨界綜合利用研究。