錢利武， 戴五好， 周國勤， 王麗麗， 汪海孫*

(1.安徽省藥物研究所，安徽合肥 230022;2.安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230022;3.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230031;4.安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，安徽合肥 230601)

苦參為豆科槐屬植物苦參Sophora flavescensAit.的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲止癢、通利小便和抗炎抗腫瘤等功效。山豆根系豆科槐屬植物越南槐Sophora tonkinensisGapnep.的干燥根及根莖，功效為清熱解毒、消腫利咽［1］?？鄥⒓吧蕉垢鶠槲覈Ｓ弥兴?，現(xiàn)代植物化學(xué)研究顯示苦參、山豆根的主要藥效活性成分為生物堿類化合物，其中苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿屬于苦參堿型生物堿，是由三價(jià)氮原子形成稠合的兩個(gè)哌啶環(huán) (又稱雙稠哌啶)組合而成，不同分子之間的差別表現(xiàn)在H的構(gòu)型以及雙鍵的有無。野靛堿、N-甲基金雀花堿和鷹爪豆堿分別屬于金雀花堿型和鷹爪豆堿型，與苦參堿型化合物結(jié)構(gòu)相似，野靛堿與N-甲基金雀花堿的區(qū)別在于氮原子上有一個(gè)甲基取代，具體化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

藥理學(xué)研究表明，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿及氧化槐定堿等具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤等活性，同時(shí)也存在不容忽視的毒性作用［2-7］，然而，前人的文獻(xiàn)多以單個(gè)苦參堿類化合物為對(duì)象，未能系統(tǒng)的反映苦參堿類化合物抗炎、鎮(zhèn)痛活性與化合物結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性。本研究以中藥苦參及山豆根中主要的生物堿:苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿、氧化槐果堿、野靛堿、N-甲基金雀花堿及鷹爪豆堿為研究對(duì)象，通過建立醋酸扭體疼痛模型和小鼠耳腫脹及腹腔毛細(xì)血管通透性等不同炎癥模型來研究和探討這幾種生物堿的鎮(zhèn)痛抗炎活性，以期揭示出苦參及山豆根中主要生物堿的鎮(zhèn)痛抗炎活性及其構(gòu)效關(guān)系，為苦參堿類生物堿的鎮(zhèn)痛抗炎藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 受試藥物 苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿、鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、野靛堿 (購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度均在98%以上);吲哚美辛腸溶片，上海信誼黃河制藥有限公司 (國藥準(zhǔn)字:H31020148，產(chǎn)品批號(hào)100401);醋酸地塞米松片，上海信誼藥廠有限公司 (國藥準(zhǔn)字 H31020793，產(chǎn)品批號(hào)100702)。

圖1 苦參、山豆根中生物堿的主要代表化合物

1.2 試劑 冰醋酸，上海申博化工有限公司產(chǎn)品，分析純(批號(hào)0501101);二甲苯，西隴化工股份有限公司，分析純 (批號(hào)1007032);伊文思藍(lán)，生工生物工程 (上海)有限公司 (CAS登記號(hào):314-13-6，批號(hào) ZL0706B10011Z);氯化鈉注射液，安徽豐源藥業(yè)股份有限公司 (國藥準(zhǔn)字H34021874，批號(hào)110504K1)。

1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠，雄性體質(zhì)量 (20±2)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.4儀器 TU—1810紫外可見分光光度計(jì)，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司;AEY—210型電子分析天平，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品 (編號(hào):91088);1 mL一次性無菌注射器，河南曙光健士醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司;打耳器等。

2 方法

2.1 冰醋酸致小鼠扭體的影響 取雄性昆明種小鼠，(20±2)g，隨機(jī)將小鼠分成若干組，每組8只。分別為生理鹽水模型組、地塞米松陽性對(duì)照組 (2.5 mg/kg)、各化合物分小、中、大劑量組，尾靜脈給予受試化合物、地塞米松和生理鹽水，于末次給藥30 min后腹腔注射0.8%冰醋酸0.1 mL/10 g，觀察記錄小鼠20 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù) (表現(xiàn)腹部內(nèi)凹，軀干與后肢伸張，臀部高起)，并計(jì)算抑制率［8］。

鎮(zhèn)痛抑制率 (%)=(生理鹽水組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù))/生理鹽水組平均扭體次數(shù)×100%。

2.2 二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 選取雄性昆明小鼠(20±2)g，隨機(jī)將小鼠分成若干組，每組8只，分別為生理鹽水模型組，吲哚美辛陽性對(duì)照組 (20 mg/kg)，各化合物分小、中、大劑量組，吲哚美辛組分別灌胃給予0.2 mL/10 g相應(yīng)供試液，第1天上、下午各一次，第2天給藥后0.5 h做試驗(yàn)。尾靜脈給予各化合物和生理鹽水，于末次給藥后30 min于小鼠右耳涂抹二甲苯20 μL，20 min后脫頸椎處死，剪取左右耳，用直徑為8 mm的打孔器沿左右耳片同一部位打下圓耳片，在電子天平上稱質(zhì)量，右耳與左耳質(zhì)量之差即為腫脹度。并計(jì)算腫脹抑制率［9］。

腫脹抑制率 (%)=(生理鹽水組平均兩耳質(zhì)量差-給藥組平均兩耳質(zhì)量差)/生理鹽水組平均兩耳質(zhì)量差×100%。

2.3 對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 選取雄性昆明小鼠 (20±2)g，隨機(jī)將小鼠分若干組，每組8只，分別為生理鹽水組，吲哚美辛組 (20 mg/kg)，各化合物分小、中、大劑量組，和生理鹽水組，吲哚美辛組分別灌胃給予0.2 mL/10 g相應(yīng)供試液，第1天上、下午各1次，第2天給藥后0.5 h做試驗(yàn)。尾靜脈給予各化合物和生理鹽水，末次靜脈注射給藥40 min后各小鼠尾靜脈注射0.5%依文思藍(lán)溶液0.1 mL/10 g，隨即腹腔注射0.8%的冰醋酸溶液0.1 mL/10 g，20 min后脫頸處死，暴露腹腔，用6 mL生理鹽水分3次洗滌腹腔，吸管吸出洗滌液，合并后加生理鹽水至10 mL 3 000 r/min離心15 min，取上清液于590 nm處測(cè)吸光度，并以對(duì)照組小鼠染料的滲出量為100%計(jì)算給藥組小鼠滲出量的抑制率［10］。

抑制率=(生理鹽水組滲出量-給藥組滲出量)/對(duì)照組滲出量×100%

3 結(jié)果

3.1 對(duì)冰醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響 結(jié)果顯示高劑量40 mg/kg苦參堿、槐定堿能夠顯著抑制醋酸刺激腹腔黏膜引起的疼痛反應(yīng)，顯著減少扭體次數(shù)。40 mg/kg劑量時(shí)苦參堿、槐定堿能夠有效抑制醋酸刺激腹腔黏膜引起的疼痛反應(yīng)，減少扭體次數(shù)。由于槐定堿在40 mg/kg劑量時(shí)引起部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，因而將最大安全劑量調(diào)整為30 mg/kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。其他結(jié)果見表1。

表1 苦參類生物堿對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

3.2 對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 小鼠右耳涂二甲苯后，耳廓顯著腫大，腫脹度高達(dá)16.5 mg，山豆根、苦參藥材中大部分生物堿顯著抑制二甲苯所導(dǎo)致小鼠耳廓腫脹的急性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為腫脹度降低，其中氧化苦參堿、槐果堿高劑量組對(duì)二甲苯所導(dǎo)致的急性炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用，抑制率分別為70.72%和70.42%，金雀花型生物堿活性明顯低于其它類型的生物堿，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

3.3 對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，山豆根、苦參藥材中大部分單體生物堿具有顯著的抑制炎癥滲出，降低小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的作用。其中苦參堿、槐果堿、槐定堿降低小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的活性相對(duì)較強(qiáng)。

4 討論

生物堿類化合物為中藥苦參及山豆根的主要活性成分［11-12］，一直備受研究者的關(guān)注，已有文獻(xiàn)通過灌胃、腹腔注射及肌肉注射等方式給藥，通過尾靜脈給藥的鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，苦參堿、槐果堿與其氧化產(chǎn)物氧化苦參堿和氧化槐果堿相比活性相對(duì)較強(qiáng)，N氧化物導(dǎo)致其鎮(zhèn)痛活性的降低;苦參堿、槐定堿、槐果堿三者結(jié)構(gòu)較為接近，差別在于H的空間構(gòu)型和D環(huán)上雙鍵的有無，但在鎮(zhèn)痛活性方面差異明顯，苦參堿、槐定堿鎮(zhèn)痛方面活性相對(duì)較強(qiáng)，從結(jié)構(gòu)上看可能與化合物D環(huán)上的雙鍵有關(guān);而苦參堿與槐定堿的活性接近，說明A環(huán)上H構(gòu)型對(duì)鎮(zhèn)痛活性的影響較小。鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、野靛堿屬于金雀花堿型和鷹爪豆堿型，鎮(zhèn)痛活性不明顯。

表2 苦參類生物堿對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度的影響

表3 苦參類生物堿對(duì)小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性的影響

在二甲苯所致耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)中，氧化苦參堿、槐果堿的抗炎活性明顯強(qiáng)于別的受試化合物，尾靜脈注射劑量為40 mg/kg時(shí)，腫脹抑制率分別為70.719 7% ±0.273 8%和70.424 2%±0.433 6%，而槐定堿及其他的化合物活性相對(duì)較弱，提示H-5的空間構(gòu)型與抗炎活性存在一定的相關(guān)性，同時(shí)N-1上的N→O鍵及D環(huán)上的雙鍵也是影響抗炎活性的部位。鷹爪豆堿在劑量為0.937 5 mg/kg時(shí)，腫脹抑制率達(dá)到了51.136 4%±2.401 1%，顯示出良好的抗炎活性?；惫麎A和氧化槐果堿對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性有顯著的抑制活性，尾靜脈注射劑量為40 mg/kg時(shí)，抑制率分別為43.297 5% ±1.698 9%和40.680 3% ±1.510 3%;明顯優(yōu)于苦參堿及槐定堿，說明D環(huán)上的C=C雙鍵為活性的主要部位?？鄥⒓吧蕉垢鶠榕R床常用中藥，而其生物堿是其主要活性成分，研究其結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系，對(duì)于開展苦參堿類化合物結(jié)構(gòu)修飾，研發(fā)高效低毒的抗炎鎮(zhèn)痛藥物具有一定的參考意義。

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