鄧 翀， 鄭 潔， 宋小妹

(陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽712046)

南五味子又稱華中五味子，為木蘭科植物華中五味子Schisandra sphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實，具有益氣、斂肺、生津、止渴、止瀉、斂汗、壯陽、補腎等功能，是產(chǎn)自我國的名貴中藥材［1］。2010年版中國藥典一部［2］規(guī)定的醋蒸南五味子的炮制沒有量化標(biāo)準(zhǔn)，文獻報道主要以多糖、總木脂素為評價標(biāo)準(zhǔn)［3-8］，無法體現(xiàn)醋制對南五味子化學(xué)成分的整體影響。基于此，本實驗擬以指紋圖譜為評價指標(biāo)，采用Box-Benhnken實驗設(shè)計的響應(yīng)面分析法和多元二次回歸方程擬合因素與指標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系，優(yōu)化南五味子醋制工藝參數(shù)，旨在為南五味子的臨床炮制用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 高效色譜儀 (L-2130二元泵，L-2400檢測器，日本日立公司);GB2042電子天平 (瑞典薩多利斯)。

1.2 試劑 南五味子藥材 (采購于陜西省南鄭縣，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院生藥教研室王繼濤高級實驗師鑒定為南五味子Schisamdra sphenantheraRehd.et Wils.);乙腈為色譜純，水為重蒸餾水;其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 溶液的制備 精密稱取南五味子炮制樣品粉末 (60目篩)約1 g，用55%乙醇，溶媒用量為16倍，提取時間為60 min，提取次數(shù)為2次，濾過，提取液在80℃水浴濃縮，揮干溶媒，以55%溶解，定容于25 mL量瓶中［9］。儲存于4℃，冷藏待用。

2.2 炮制樣品指紋圖譜方法建立

2.2.1 色譜條件 依利特ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動相為乙腈 (A)-水(0.2%磷酸)梯度洗脫 (0～10 min，5% ～30%A;10～20 min，30% ～42%A;20～30 min，42% ～52%A;30～50 min，52% ～48%A;50～60 min，48% ～48%A;60～70 min，48% ～55%A;70～80 min，55% ～70%A;80～85 min，70% ～85%A;85～90 min，85% ～95%A;90～100 min，95% ～100%A;100～110 min，100% ～100%A);體積流量0.8mL/min;檢測波長230 nm;進樣量10 μL。色譜圖見圖1。經(jīng)對照品鑒定，10號峰為五味子甲素。本實驗主要以指紋圖譜共有色譜峰峰面積綜合評分為評價指標(biāo)，故未列出對照品相關(guān)色譜圖。

圖1 南五味子指紋圖譜共有色譜峰Fig.1 HPLC chromatogram of Schisandra sphenanthera

2.2.2 精密度試驗 以2.2.1項色譜條件下，取編號為1的供試品溶液10 μL，重復(fù)分析5次，記錄指紋圖譜。共有色譜峰數(shù)據(jù)顯示，各峰相對保留時間的RSD不大于0.2%，各峰相對峰面積的RSD不大于2.0%。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 以2.2.1項色譜條件下，分別取編號為1的供試品溶液10 μL，于0、4、8、12、16、24 h進樣采集色譜圖數(shù)據(jù)。共有色譜峰數(shù)據(jù)顯示，各峰相對保留時間的RSD不大于0.4%，相對峰面積的RSD不大于5%，說明供試樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗 精密稱取編號為1的南五味子炮制樣品粉末5份，每份1.0 g，按2.1項下條件制備供試品溶液，在2.2.1項色譜條件下進行HPLC分析，記錄指紋圖譜數(shù)據(jù)。共有色譜峰數(shù)據(jù)顯示，各峰相對保留時間的RSD不大于0.2%，相對峰面積的RSD不大于5.0%。

2.3 炮制工藝研究方案 根據(jù)文獻資料 ［3-8］，選擇南五味子醋制炮制工藝考察因素為加醋量、悶潤時間、蒸制時間。采用Design Expert 8.05軟件Box-Behnken試驗設(shè)計的3因素3水平設(shè)計方法設(shè)計實驗方案。試驗因素水平設(shè)計見表1，共設(shè)計17組炮制實驗點。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計考察因素與水平編碼Tab.1 Factors and levels Box-Behnken RSM test

2.4 數(shù)據(jù)處理方法 采用信息量權(quán)重法對數(shù)據(jù)進行處理，采用均值標(biāo)準(zhǔn)差法對數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)各評價指標(biāo)包含的信息量來確定權(quán)重，采用變異系數(shù)法，變異系數(shù)越大，該化學(xué)成分所賦的權(quán)重越大［10-14］。

圖2 悶潤時間和加醋量對綜合評分影響的三維曲面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour plots of multual-influence of the amount of vinegar and moistening time on comprehensive score

以Xij表示第i次實驗中第j個指標(biāo)的測定值，i=1，2，…，n;j=1，2，…，k。首先以各指標(biāo)的最大值 (即各色譜圖中同一相對保留時間的各色譜峰中峰面積值最大者)作為參照，對同一指標(biāo)各數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，Dij表示第j個指標(biāo)下的第i個測定值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。

按各指標(biāo)變異系數(shù)確定加權(quán)系數(shù)。以RSDj表示第j個指標(biāo)的變異系數(shù);根據(jù)各色譜峰的重要程度賦權(quán)值為Ej，由于無法確定各組分的貢獻大小，故認為指紋圖譜中的各個色譜峰所代表的各組分貢獻值相同，均設(shè)為1。主要以各組數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)差確定其權(quán)重系數(shù):

因此，多指標(biāo)實驗公式為:

(3)式計算所得的兼顧各指標(biāo)綜合效應(yīng)的公式，得分越大越好。

3 結(jié)果

3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

3.1.1 醋制工藝綜合評分回歸模型的建立 Box-Behnken實驗設(shè)計方案和各指紋圖譜的共有色譜峰的綜合評分?jǐn)?shù)據(jù)見表2。

將表2中各組綜合評分?jǐn)?shù)據(jù)采用Design Expert 8.05軟件進行多元回歸和二項式分析，建立南五味子醋制工藝綜合評分 (Y)對3個因素 (X1、X2、X3)的二次回歸模型方程為:Y=55.53+3.95×X1-0.14×X2-0.48×X3-0.059×X1×X2+0.48×X1×X3+1.87×X2×X3-2.42×X21-2.94×X22-1.77×X23。不同考察因素與綜合評分的響應(yīng)面分析見圖2～圖4的三維曲線及等高線。

表2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果Tab.2 Design and results for response surface analysis

3.1.2 方程的顯著性檢驗 對綜合評分 (Y)與3個因素的回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。方差分析顯示，模型的F=11.70(P=0.001 9，小于0.01)，表明實驗結(jié)果誤差較小，模型的失擬項F=1.26(P=0.402，大于0.05)，表明失擬項誤差對模型沒有顯著性影響，模型擬合合理。方差分析結(jié)果顯著分別是一次項X1，交互項X2X3，二次項X21、X22、X23，表明各考察因素對綜合評分的影響不僅是線性關(guān)系，還存在交互綜合影響。模型的相關(guān)系數(shù)平方為0.937 7，表明該模型比較準(zhǔn)確地反映醋制南五味子化學(xué)成分譜綜合評分與加醋量、悶潤時間、蒸制時間的關(guān)系，可以用該回歸方程對醋制南五味子炮制工藝進行分析與預(yù)測。

圖3 醋蒸時間和加醋量對綜合評分影響的三維曲面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour plots of multual-influence of the amount of vinegar and steaming time on comprehensive score

圖4 醋蒸時間和悶潤時間對綜合評分影響的三維曲面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour plots of multual-influence ofsteaming time and moistening time on comprehensive score

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis for the regression model established

3.2 最佳工藝條件預(yù)測與試驗驗證 通過回歸模型的預(yù)測，得到南五味子醋制最佳工藝條件為每100 g藥材加醋量為28.10 g，悶潤時間1.95 h，蒸制時間3.90 h?？紤]到工業(yè)化生產(chǎn)的實際操作，將提取工藝參數(shù)修正為每100 g藥材加醋量為30 g，悶潤時間2 h，蒸制時間4 h。為檢驗實驗結(jié)果的可靠性，采用上述工藝參數(shù)進行南五味子炮制工藝試驗進行3次平行試驗，在上述工藝參數(shù)下炮制南五味子綜合評分值與理論預(yù)測值吻合程度良好。

4 討論

4.1 文獻報道南五味子醋制炮制工藝多以多糖、總木脂素為評價標(biāo)準(zhǔn)進行研究［3-8］，本實驗以指紋圖譜共有色譜峰峰面積綜合評分為評價指標(biāo)，從化學(xué)成分譜角度對南五味子醋制工藝進行研究，共有色譜峰峰面積綜合評分沒有預(yù)先設(shè)定指標(biāo)，主要反映炮制因素影響下化學(xué)成分群在炮制過程的整體變化情況，可以從整體角度反映炮制因素差異導(dǎo)致化學(xué)組分變化，突破以單一化學(xué)部位或單一成分為評價指標(biāo)的片面性。采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)選醋制五味子的炮制工藝，經(jīng)Design Expert 8.05軟件分析實驗數(shù)據(jù)，篩選出的炮制工藝為每100 g藥材加醋量為28.10 g，悶潤時間1.95 h，蒸制時間3.90 h，考慮到工業(yè)化生產(chǎn)的實際操作將醋制南五味子炮制工藝修正為每100 g藥材加醋量為30 g，悶潤時間2 h，蒸制時間4 h。

4.2 目前關(guān)于南五味子的炮制工藝研究報道主要通過正交實驗設(shè)計［3-8］，它不能在給出的整個區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個明確的函數(shù)表達式即回歸方程，從而無法找到整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值［15］。而響應(yīng)面法是通過一系列確定性的試驗擬合一個響應(yīng)面來模擬真實極限狀態(tài)曲面。將多因子實驗中，因子與實驗結(jié)果的相互關(guān)系，用多項式近似，把因子與實驗結(jié)果 (響應(yīng)值)的關(guān)系函數(shù)化，依此可進行函數(shù)的面分析，研究因子與響應(yīng)值之間，因子與因子之間的相互關(guān)系，并進行優(yōu)化，從而找到整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，最終篩選和預(yù)測最佳的工藝參數(shù)，在實驗設(shè)計中更科學(xué)、更準(zhǔn)確。

［1］魏景文.五味子藥理研究新進展［J］.天津藥學(xué)，2009，21(5):55-57.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京，中國醫(yī)藥科技出版社，2010:298.

［3］李 莉，陸兔林，黃 瑋，等.高壓醋蒸五味子炮制工藝研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，25(2):110-113.

［4］宋小妹，崔九成，孫寶平，等.醋南五味子炮制工藝研究［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，32(3):65-66.

［5］殷放宙，陸兔林，蔡寶昌.炮制對五味子中木脂素的影響［J］.中草藥，2009，37(9):1341-1344.

［6］孫華芳，李 潔.正交實驗法優(yōu)選南五味子的炮制工藝［J］.西北藥學(xué)雜志，2009，24(5):369-370.

［7］孫 靜，吳 瑛.醋蒸南五味子炮制工藝的研究［J］.貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，33(2):26-28.

［8］蒲宇紅，王曉義，李國昌.正交設(shè)計優(yōu)選醋制五味子的炮制工藝［J］.中國藥師，2007，10(2):186-187.

［9］鄧 翀，顏永剛，梁 婷，等.多指標(biāo)綜合評價南五味子木脂素提取工藝［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(9):4-6.

［10］王 暉，陳 麗，陳 墾，等.多指標(biāo)綜合評價方法及權(quán)重系數(shù)的選擇［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報，2007，23(5):583-589.

［11］于魯海，李燕菊，孫 力，等.利用活性部位指紋圖譜篩選驅(qū)蟲斑鳩菊提取工藝［J］.中藥材，2007，30(12):1589-1591.

［12］劉雅敏，郭丹丹，楊 晉，等.指紋圖譜法優(yōu)選訶子提取工藝的研究［J］.中成藥，2011，33(7):1168-1171.

［13］于魯海，徐建國，李燕菊，等.指紋圖譜在驅(qū)蟲斑鳩菊澄清工藝中的應(yīng)用［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2007，(7):57-59.

［14］鄧 翀，顏永剛，姚天鵝.正交實驗結(jié)合指紋圖譜篩選白鮮皮提取工藝［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，34(4):25-34.

［15］周桂芬，呂圭源，陳素紅.響應(yīng)面分析法優(yōu)化加速溶劑萃取當(dāng)歸中阿魏酸的工藝參數(shù)［J］.中成藥，2010，32(5):775-778.