王秀芹， 林 彤， 顧利紅

(1.廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510160)

千柏鼻炎膠囊由千里光、卷柏、決明子、麻黃、羌活等七味中藥加工制成，為常用中藥品種，用于急慢性鼻炎，過(guò)敏性鼻炎，鼻竇炎及咽炎等。千柏鼻炎膠囊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑 (第十四冊(cè))》，其中僅有千里光和麻黃薄層色譜鑒別，以此兩項(xiàng)鑒別來(lái)控制產(chǎn)品的質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，提高人民用藥安全性，作者對(duì)千柏鼻炎膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，進(jìn)一步完善千柏鼻炎膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在部頒標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加決明子和羌活薄層鑒別，同時(shí)千里光作為處方中君藥，占整個(gè)處方量的76%，原標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有定量測(cè)定項(xiàng)，為此采用HPLC法對(duì)千里光藥材中的主要成分對(duì)羥基桂皮酸和金絲桃苷進(jìn)行定量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津 LC-10AT HPLC色譜儀;SPDM20A檢測(cè)器;CLASS-VP色譜工作站。

1.2 試藥 對(duì)照藥材:千里光 (批號(hào)120964-200707)，決明子 (批號(hào) 120923-200912)，麻黃(批號(hào)121051-200704)。對(duì)照品:大黃酚 (110796-201017)，鹽酸麻黃堿 (批號(hào)171241-201007)，金絲桃苷 (批號(hào)11521-200303)，對(duì)羥基桂皮酸 (批號(hào)30-2018)。上述對(duì)照藥材及對(duì)照品除對(duì)羥基桂皮酸對(duì)照品購(gòu)買于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心外，其余均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。千柏鼻炎膠囊樣品 (批號(hào)8004、8005、8006)及陰性對(duì)照均由廣州奇星藥業(yè)提供。所有試劑除乙腈為色譜純;其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別試驗(yàn)

2.1.1 千里光TLC鑒別［1］取本品10粒的內(nèi)容物，研細(xì)，加乙醇40 mL，置水浴中加熱回流1 h，濾過(guò)，取濾液約15 mL(剩余的濾液備用)，水浴上濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另外稱取千里光對(duì)照藥材25 g，加水后煎煮1 h，濾過(guò)，濾液濃縮成稠膏，加乙醇40 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。取相當(dāng)于成品量10粒的缺千里光陰性對(duì)照品，按同法制備千里光陰性對(duì)照溶液。按照TLC法［2］試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL、對(duì)照藥材溶液5 μL后點(diǎn)于硅膠G薄層板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 (5∶4∶1)為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，取出后晾干，噴茴香醛-硫酸-甲醇 (2.5∶2.5∶100)顯色劑，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中在對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，并且千里光陰性對(duì)照未出現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 千里光TLC圖譜Fig.1 TLC of Senecionis scandentis Herba

2.1.2 決明子TLC鑒別［3］取2.1.1項(xiàng)下的備用濾液，水浴蒸干后殘?jiān)铀?0 mL溶解，加鹽酸1 mL后置水浴中加熱回流30 min，立即冷卻，分液漏斗經(jīng)乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并提取液后揮干，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為供試品溶液。取決明子對(duì)照藥材1 g，加水適量，電爐上煎煮1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至10 mL，按同法制備決明子對(duì)照藥材溶液。取相當(dāng)于成品量10粒的缺決明子陰性樣品，按同法制成陰性對(duì)照溶液。大黃酚對(duì)照品以甲醇溶解后制成溶液 (1 mg/mL)作為對(duì)照品溶液。按照TLC法［2］試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL、對(duì)照藥材溶液和大黃酚對(duì)照品溶液各 5 μL，分別點(diǎn)于硅膠 H薄層板(0.5%羧甲基纖維素鈉為黏合劑)后以石油醚(30～60℃)—甲酸乙酯—甲酸 (15∶5∶1)展開(kāi)劑展開(kāi)，取出后晾干，噴氫氧化鉀飽和乙醇溶液后于日光下觀察。供試品色譜中，在對(duì)照藥材色譜及大黃酚對(duì)照品色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，決明子陰性對(duì)照未出現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 決明子TLC圖譜Fig.2 TLC of Cassiae Semen

2.1.3 麻黃TLC鑒別 取本品10粒的內(nèi)容物，加濃氨試液1 mL和三氯甲烷20 mL，置水浴上回流30 min，過(guò)濾后蒸干濾液，殘?jiān)眉状? mL溶解，作為供試品溶液。取麻黃對(duì)照藥材1 g，按同法制成對(duì)照藥材溶液。取相當(dāng)于成品量10粒的缺麻黃陰性樣品，按同法制成陰性對(duì)照溶液。鹽酸麻黃堿對(duì)照品以甲醇溶解后制成溶液 (1 mg/mL)作為對(duì)照品溶液。按照TLC法［2］試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板 (0.5%羧甲基纖維素鈉為黏合劑)，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液 (4∶1∶0.1)為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，取出后晾干，噴以茚三酮試液后于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，分別在與對(duì)照藥材及鹽酸麻黃堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色紅色斑點(diǎn)，麻黃陰性對(duì)照未出現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

圖3 麻黃TLC圖譜Fig.3 TLC of Ephedrae Herba

2.1.4 羌活TLC鑒別［4-5］取本品15粒的內(nèi)容物，研細(xì)，加乙醚20 mL，搖勻，浸泡30 min，濾過(guò)后揮干濾液，殘?jiān)砸宜嵋阴? mL溶解作為供試品溶液。另取羌活對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取相當(dāng)于成品量15粒的缺羌活陰性對(duì)照樣品，按同法制成陰性對(duì)照溶液。按照TLC法［2］試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以石油醚 (60～90℃)-乙酸乙酯 (3∶1)展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，取出后晾干，噴5%香草醛硫酸溶液顯色劑后于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，羌活陰性未出現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)。見(jiàn)圖4。

2.2 定量測(cè)定［6-12］

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Kromasil色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.2%冰醋酸 (15∶85);柱溫35℃;體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)310 nm(0～20 min)，360 nm(20～30 min);進(jìn)樣量10 μL。該條件下對(duì)羥基桂皮酸峰和金絲桃苷峰與相鄰峰分離度均大于1.5，千里光陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖5。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)羥基桂皮酸和金絲桃苷對(duì)照品適量后分別以甲醇溶解，質(zhì)量濃度均為30 μg/mL，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 將千柏鼻炎膠囊樣品研細(xì)后稱取約0.5 g，精密稱定后置圓底燒瓶中，精密加入75%甲醇25 mL后稱定質(zhì)量，水浴中加熱回流1 h后放冷、稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量后搖勻過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

圖5 HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatagrams

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取相當(dāng)于成品量0.5 g的缺千里光陰性對(duì)照樣品，同法制成千里光陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)羥基桂皮酸和金絲桃苷對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得線性方程為對(duì)羥基桂皮酸Y=6×108X+6 143.6，r=1;金絲桃苷Y=2×106X-6 521.8，r=0.999 9。結(jié)果表明對(duì)羥基桂皮酸在0.035 75～0.893 75 μg范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好;金絲桃苷在0.032 86～0.821 5 μg范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)測(cè)定6次，對(duì)羥基桂皮酸峰面積積分值RSD為0.5%，金絲桃苷峰面積積分值RSD為0.8%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)千柏鼻炎膠囊(批號(hào)8004)樣品細(xì)粉約0.5 g，精密稱取6份，按2.2.3項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，結(jié)果對(duì)羥基桂皮酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.108 7 mg/g，RSD為 1.3%(n=6);金絲桃苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.612 7 mg/g，RSD為2.0%(n=6)。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品 (批號(hào)8004)溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h測(cè)定樣品中對(duì)羥基桂皮酸和金絲桃苷的含有量，結(jié)果對(duì)羥基桂皮酸、金絲桃苷含有量的RSD均為1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量千柏鼻炎膠囊 (批號(hào)8004)的樣品粉末約0.25 g，精密稱取共6份，置圓底燒瓶中，分別精密加入對(duì)羥基桂皮酸和金絲桃苷混合對(duì)照品溶液25 mL，稱定質(zhì)量，按2.2.3項(xiàng)下方法制備，分別測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.10 樣品測(cè)定 取千柏鼻炎膠囊樣品3批，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

表2 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of samples

3 討論

3.1 千里光的薄層色譜鑒別實(shí)驗(yàn)中按照原方法噴三氯化鐵顯色，結(jié)果陰性對(duì)照有干擾，實(shí)驗(yàn)中將噴三氯化鐵試液顯色改為噴茴香醛-硫酸-甲醇 (2.5∶2.5∶100)溶液，結(jié)果供試品溶液顯色斑點(diǎn)清晰，且千里光陰性對(duì)照無(wú)干擾。

3.2 決明子的薄層色譜鑒別為新增加的薄層鑒別，實(shí)驗(yàn)方法參照《中國(guó)藥典》2010年版一部“千柏鼻炎片”的［鑒別］(2)，結(jié)果供試品薄層色譜中在與決明子為對(duì)照藥材相應(yīng)位置處只有大黃酚一個(gè)黃色斑點(diǎn)一致，實(shí)驗(yàn)中將其檢視方式由紫外光燈(365 nm)下觀察改為噴氫氧化鉀飽和溶液于日光下檢視，結(jié)果斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)性好，決明子陰性對(duì)照無(wú)干擾，具有專屬性。

3.3 定量測(cè)定中曾比較甲醇、75%甲醇、50%甲醇回流1 h的提取效果，結(jié)果以75%甲醇為提取溶劑，對(duì)羥基桂皮酸和金絲桃苷兩者均較完全提取，為此選擇75%甲醇為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)中考察了回流提取30、60 min和90 min的提取效果，結(jié)果3個(gè)回流提取時(shí)間含有量測(cè)定結(jié)果基本一致，為保證提取完全，最后選擇回流時(shí)間為60 min。

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