林麗美， 許招懂， 姚江雄， 劉菊妍， 李 春， 王智民*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙 410208;2.廣州星群 (藥業(yè))股份有限公司，廣東廣州 510288;3.廣州醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，廣東廣州 510130;4.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

夏桑菊顆粒為夏枯草、桑葉、野菊花三味藥材經(jīng)加工制成，具有清肝明目，疏風(fēng)散熱，除濕痹，解瘡毒之功效。用于風(fēng)熱感冒，目赤頭痛，高血壓，頭暈耳鳴，咽喉腫痛，疔瘡腫毒等癥，并可作清涼飲料。

夏桑菊顆粒原標(biāo)準(zhǔn)收載于中華人民共和國衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn) (部頒標(biāo)準(zhǔn))第15冊，標(biāo)準(zhǔn)編號:WS3-B-2967-98。原標(biāo)準(zhǔn)收載了該藥品的處方、制法、性狀、鑒別、檢查、主治與功能、用量與用法、規(guī)格和貯藏9個項(xiàng)目。根據(jù)國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高行動計(jì)劃的要求，對夏桑菊顆粒原標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂。由于夏桑菊顆粒的君藥是夏枯草，參考2010年版《中國藥典》選擇夏枯草主要藥效成分迷迭香酸為質(zhì)控指標(biāo)［1］?，F(xiàn)有采用紫外-可見分光光度法和HPLC方法對夏枯草中迷迭香酸含有量進(jìn)行了測定［2-4］，但是對夏桑菊顆粒中迷迭香酸的含有量測定尚沒有報道。同時夏桑菊顆粒組成藥材野菊花中最為代表性成分為蒙花苷。因此，本實(shí)驗(yàn)增加了夏桑菊顆粒中迷迭香酸和蒙花苷TLC鑒別和HPLC定量測定，為提高夏桑菊顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 KQ—100B型超聲波清洗器 (昆山超聲儀器有限公司);BPZ11D型電子分析天平 (Sartorius公司);Waters2695-2996高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站，含四元梯度泵、自動進(jìn)樣器(Waters公司)。

1.2 試劑 甲醇 (色譜純，TEDIA公司)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)，水為娃哈哈純凈水;三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、濃硫酸 (分析純，北京化工廠)，香草醛 (武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司);聚酰胺薄膜和硅膠G薄層板 (青島海洋化工廠)。

1.3 對照品及樣品 對照品迷迭香酸和蒙花苷(本課題組自制，純度大于98%)［5］;夏桑菊顆粒從市場上購買。TLC鑒別試驗(yàn)樣品具體信息見表1。

表1 TLC中夏桑菊顆粒樣品信息Tab.1 Samples of Xiasangju Granules for TLC

2TLC鑒別

2.1 TLC條件 迷迭香酸 展開劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸 (8∶2∶0.5);溫度20℃;相對濕度38%;紫外光燈為365 nm;顯色劑為1%香草醛濃硫酸，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。蒙花苷乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水 (15∶15 ∶6 ∶4 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。

2.2 對照品的制備 取對照品迷迭香酸和蒙花苷適量，精密稱定，加甲醇溶解，配置成質(zhì)量濃度分別為0.307 4 mg/mL和0.100 3 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品制備 分別取夏桑菊顆粒樣品，陰性對照 (缺夏枯草或缺野菊花)10 g，加甲醇15 mL，超聲30 min(功率250W，頻率40 kHz)，取出，靜置，放涼，過濾，濾液分別作為夏桑菊顆粒的供試品溶液和相應(yīng)陰性對照溶液。

2.4 鑒別 分別取各樣品溶液15 μL，按照2.1項(xiàng)TLC條件進(jìn)行。供試品色譜中，在與對照品色譜的相應(yīng)位置上，有相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對照沒有相應(yīng)斑點(diǎn)，表明迷迭香酸為夏桑菊顆粒君藥夏枯草中的成分，蒙花苷為野菊花中的成分。按照上述條件所得的TLC圖譜見圖1～3。

圖1 TLC圖譜 (UV 365 nm)Fig.1 Chromatogram of TLC(UV 365 nm)

圖2 TLC圖譜Fig.2 Chromatogram of TLC

圖3 TLC圖譜 (UV 365 nm)Fig.3 Chromatogram of TLC(UV 365 nm)

3 HPLC定量測定

3.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);體積流量1.0 mL/min;檢測波長329 nm;柱溫30℃;樣品溫度20℃;進(jìn)樣體積10 μL;分離迷迭香酸和蒙花苷的流動相分別為20%乙腈-80%水 (含1.0% 乙酸乙酯)和25%乙腈-75%水 (0.5%磷酸)等度洗脫。按照上述色譜條件，迷迭香酸和蒙花苷分離很好，無干擾，所得色譜圖見圖4和圖5。

圖4 對照品 (A)、夏桑菊顆粒 (B)和缺夏枯草陰性對照樣品 (C)HPLC色圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of reference substance(A)，Xiasangju Granules(B)and negative samples without Prunella vulgaris(C)

圖5 對照品 (A)、夏桑菊顆粒 (B)和缺野菊花陰性對照樣品 (C)HPLC色圖譜Fig.5 HPLC chromatogramsofreferencesubstance(A)，Xiasangju Granules(B)and negative samples without Chrysanthemum indicum L.(C)

3.2 供試品溶液制備 稱夏桑菊顆粒約2.5 g，精密稱定，加甲醇10 mL，稱質(zhì)量，超聲30 min(功率250W，頻率40 kHz)，取出，靜置，放涼，補(bǔ)質(zhì)量，0.22 μm微孔濾膜濾過，HPLC分析。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取迷迭香酸和蒙花苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，定容，分別得質(zhì)量濃度為 0.22 μg/μL 和 0.050 5 μg/μL 的對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液1、2、3、5、10、15、20、25、30、40 μL進(jìn)樣分析，記錄按上述色譜條件測定的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo) (Y)，進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo) (X)，得迷迭香酸回歸方程Y=4 541 216.83X-411 008.21(r=0.999 9)，線性范圍為0.22～8.80 μg。蒙花苷線性方程Y=1 734 753.44X+546 792.12(r=0.999 6)，線性范圍為0.101 ～2.02 μg。

3.4 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測定迷迭香酸和蒙花苷的峰面積，其RSD為0.50%和0.62%。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測定迷迭香酸和蒙花苷的峰面積，其RSD為1.01%和0.98%。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份樣品6份，精密稱定，按照3.2項(xiàng)下制備供試品溶液，按上述色譜條件測定迷迭香酸和蒙花苷的峰面積，其RSD為0.77%和1.22%。

3.7 回收率試驗(yàn) 取同一批已知含有量的夏桑菊顆粒樣品約1.25 g，6份，精密稱定，分別精密加入一定量迷迭香酸和蒙花苷對照品溶液，按3.2項(xiàng)制成加樣供試品溶液，按上述色譜條件測定含有量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn) (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

3.8 樣品測定 按照上述色譜條件，將不同廠家的樣品進(jìn)行處理和進(jìn)樣，每一個相同廠家及批號的樣品稱3份，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算夏桑菊顆粒中迷迭香酸和蒙花苷的含有量，計(jì)算平均值。結(jié)果見表3。

4 討論

4.1 到目前為止，中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究一般以TLC和HPLC方法為主，采用合適的指標(biāo)建立其標(biāo)準(zhǔn)［6-10］。因此，本實(shí)驗(yàn)以特征成分迷迭香酸和蒙花苷為指標(biāo)，采用TLC和HPLC建立大品種夏桑菊顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 在建立迷迭香酸TLC方法時，展開劑選擇采用了三氯甲烷-甲醇、三氯甲烷-甲醇-水、三氯甲烷-甲醇-甲酸和乙酸乙酯-正丁醇等系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三氯甲烷-甲醇-甲酸系統(tǒng)最為合適;在顯色后，一定要加熱，加熱到斑點(diǎn)清晰即可。在建立HPLC方法時，如果方法選擇不當(dāng)?shù)脑?，陰性一直顯示有干擾，關(guān)鍵是要注意溫度的控制。

4.3 采用TLC的方法分析迷迭香酸和蒙花苷在夏桑菊顆粒中的對應(yīng)關(guān)系，結(jié)果說明供試品色譜中，在與對照品色譜的相應(yīng)位置上，有相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對照沒有相應(yīng)斑點(diǎn);迷迭香酸僅存在于夏桑菊顆粒組成君藥夏枯草之中，而桑葉和野菊花中沒有該化合物;蒙花苷僅存在于野菊花中，夏枯草和桑葉均不含該化合物。因此，該方法不僅簡單，易重復(fù)，而且具有明顯的實(shí)用性，可以作為夏桑菊顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一。

表3 樣品測定結(jié)果 (n=3)Tab.3 Results of sample determination(n=3)

4.4 采用HPLC方法建立了夏桑菊顆粒中迷迭香酸和蒙花苷的定量測定方法。樣品處理容易、可控，所建立的色譜條件簡單，分析時間在15 min以內(nèi)，等度洗脫，適宜于夏桑菊顆粒大量樣本中該化合物含有量測定，有很好的實(shí)用性;結(jié)果表明，所測樣品中迷迭香酸和蒙花苷的含有量差別很大，說明現(xiàn)在市面上流通的夏桑菊顆粒的質(zhì)量參差不齊，但是迷迭香酸含有量高的廠家其蒙花苷含有量也相對較高，估計(jì)可能與各廠家的工藝過程密切相關(guān)。根據(jù)上面所得的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，部分生產(chǎn)廠家夏桑菊顆粒含迷迭香酸和蒙花苷較多，且比較穩(wěn)定，建議增加夏桑菊顆粒中迷迭香酸和蒙花苷的含有量測定，其中迷迭香酸含量不少于1.50 mg/袋，蒙花苷含量不少于0.50 mg/袋。

總之，中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一個復(fù)雜艱巨體系［11］，但其重要性激勵著科研工作者不斷的探索和創(chuàng)新［12-13］。夏桑菊顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也是一個開放的系統(tǒng)，每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)共同組成夏桑菊顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，達(dá)到有效控制夏桑菊顆粒質(zhì)量的目的。

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