陳艷芬， 王春怡， 李衛(wèi)民， 高 英*， 唐春萍， 楊超燕， 薛秀敏

(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州 510006;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006)

糖尿病并發(fā)癥發(fā)病的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說認(rèn)為，在持續(xù)高糖狀態(tài)下，線粒體活性氧簇 (ROS)生成增加可能是糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，氧自由基生成增多導(dǎo)致的氧化應(yīng)激既是糖尿病微血管病變發(fā)生、發(fā)展的重要影響因素，也是導(dǎo)致心肌損傷的重要因素［1］。因此針對(duì)糖尿病抗氧化治療的臨床與動(dòng)物研究成為糖尿病及其慢性并發(fā)癥預(yù)防與治療用藥的重要評(píng)價(jià)手段［2］。黃芪葛根湯方源自古籍，益氣健脾，滋陰清熱，生津止渴，前期通過鏈脲佐菌素 (STZ)糖尿病和氫化可的松胰島素抵抗小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有改善胰島素抵抗、降血糖作用;在病理觀察中發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠病程持續(xù)一段時(shí)間后心肌線粒體增多異常明顯，線粒體腫脹變性，嵴斷裂、溶解，形成空泡區(qū)，黃芪葛根湯能明顯改善心肌超微結(jié)構(gòu)。因此，為進(jìn)一步探討該方對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)作用及機(jī)制，本研究通過建立2型糖尿病心肌病大鼠模型，觀察黃芪葛根湯對(duì)心肌氧化應(yīng)激和NF-κB表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2003—0002，粵監(jiān)證字2008A020，飼養(yǎng)環(huán)境符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求。

1.1.2 藥物與試劑 黃芪葛根湯由黃芪、葛根等組成，其浸膏每1 g相當(dāng)于生藥1.71 g，相對(duì)密度1.22(50℃)，臨用時(shí)用蒸餾水稀釋至所需濃度;鹽酸羅格列酮，貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20070502;STZ，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;血糖試劑盒，上?？迫A生物工程股份有限公司;血脂檢測(cè)試劑盒:甘油三脂 (TG)，膽固醇 (TC)，高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，北京中生北控生物科技股份有限公司;SOD，MDA，GSH-Px和組織蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程公司，批號(hào)為20080912和20080829?？?RNA提取試劑 Trizol，Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒，TIANGEN公司。

1.1.3 主要儀器 AV5421全自動(dòng)生化分析儀(奧林巴斯公司產(chǎn)品);UV-1800型紫外可見光光度計(jì) (北京瑞利分析儀器公司);AB2700 PCR擴(kuò)增儀 (美國(guó)AB公司);PAC 300電泳儀 (美國(guó)BIO-RAD公司);Gel 100凝膠成像系統(tǒng) (美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立、分組與給藥 大鼠先用高脂高熱量飼料喂養(yǎng)4周 (由基礎(chǔ)鼠料加酪蛋白、蔗糖、豬油等按比例組成，其中基礎(chǔ)鼠料52%，酪蛋白12%，蔗糖10%，豬油24%，磷酸氫鈣2%，復(fù)合多維0.1%，礦物質(zhì)0.4%，鹽0.2%)，再以小劑量STZ 30 mg/kg腹腔注射 (正常對(duì)照組同時(shí)采用檸檬酸緩沖液腹腔注射)，1周后取血測(cè)空腹血糖 (FBG)和糖耐量。選擇糖耐量異常 (2 hBG≥7.8 mmol/L)的60只成模大鼠納入實(shí)驗(yàn)。成模大鼠隨機(jī)分成五組 (模型組，羅格列酮組，黃芪葛根湯高、中、低劑量組)，繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)8周。正常組10只大鼠一直采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。每周稱體質(zhì)量1次，記錄體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量。采用代謝籠收集大鼠24 h尿液。各組分別按體質(zhì)量灌胃給藥，每天1次，正常組和模型組則予以等體積的蒸餾水，8周后處死動(dòng)物取材。

1.2.2 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后禁食12 h，大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min，4℃，離心10 min取上清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖 (FBG)和血脂。參考文獻(xiàn)采用大鼠不禁食狀態(tài)下下午所測(cè)得的隨機(jī)血糖視為餐后血糖(PBG)。取血后處死大鼠，迅速取出心臟，剪除包膜、血管，取約100 mg左心室肌組織裝入凍存管保存?zhèn)溆?，擇日?～4℃條件下制成100 g/L心肌組織生理鹽水勻漿液，按試劑盒方法測(cè)定SOD，MDA，GSH-Px。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)心肌組織NF-κB mRNA表達(dá)按Trizol試劑說明提取心肌組織總RNA，取2 μg總RNA進(jìn)行RT反應(yīng)，然后取RT產(chǎn)物進(jìn)行NF-κB和內(nèi)參β-actin的PCR反應(yīng)。其中β-actin的上游引物5'-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'，下游引物5'-GCAGTAATCTCCTTCTGCATCC-3'， 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物600 bp。NF-κB 上游 引物 5'-GGGACTATGACTTGAATGCG-3'，下 游 引 物 5'-CAGGCTAGGGTCAGCGTAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物300 bp。NF-κB反應(yīng)體系為:RT反應(yīng)產(chǎn)物1 μL，β-Actin上、下游引物 (5 μmol/L)各 0.5 μL，NF-κB 上、下游引物 (10 μmol/L)各 1 μL ，2 ×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，總體積25 μL。NF-κB 反應(yīng)步驟為:94℃ 5 min 1循環(huán)，94℃ 30、56℃ 30、72℃ 1 min共30循環(huán)，72℃7 min 1循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖膠上電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行照相，測(cè)定各產(chǎn)物電泳條帶光密度值，計(jì)算目的基因光密度和內(nèi)參光密度比值作為NF-κB mRNA的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般體征 (體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量、尿量)觀察 正常對(duì)照組大鼠毛色光亮、潔白，體態(tài)活潑，無多飲、多尿現(xiàn)象，體質(zhì)量逐漸增加。造模大鼠在前4周高脂飼料喂養(yǎng)期體質(zhì)量增加明顯，其它外觀體征與正常組無明顯區(qū)別，但在注射STZ 1周后，體質(zhì)量有所下降，隨著時(shí)間的推移體質(zhì)量增加明顯，尤其是模型組大鼠，并出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿。經(jīng)過各組藥物干預(yù)治療后，大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量和飲水量有不同程度改善。采用代謝籠收集24 h尿量，糖尿病模型組大鼠與正常對(duì)照組比較，尿量顯著升高 (P＜0.01);黃芪葛根湯高、中劑量組、羅格列酮組與模型組相比，尿量顯著降低 (P＜0.05或P＜0.01)，說明黃芪葛根湯、羅格列酮能明顯改善糖尿病多尿癥狀(結(jié)果見表1)。

2.2 黃芪葛根湯對(duì)大鼠血糖的影響 由表1可見，與正常組相比，模型組空腹血糖和餐后血糖都顯著升高 (P＜0.01)，說明2型糖尿病模型造模成功。與模型組比較，黃芪葛根湯高、中劑量組，羅格列酮組的空腹血糖明顯降低;黃芪葛根湯中劑量組、羅格列酮組的餐后血糖也明顯降低。

表1 黃芪葛根湯對(duì)糖尿病心肌病大鼠血糖和尿量的影響Tab.1 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood glucose and urinary volume in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=8)

表1 黃芪葛根湯對(duì)糖尿病心肌病大鼠血糖和尿量的影響Tab.1 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood glucose and urinary volume in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=8)

與正常組比較，▲▲ P＜0.01;與模型組比較＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg-1) FBG/(mmol·L-1) PBG/(mmol·L-1) 24 h尿量 (mL·g-1·100-1)正常組-5.55±0.58 7.09±1.56 4.82±1.35模型組 - 15.77±4.28▲▲ 17.14±4.75▲▲ 9.22±4.80▲▲黃芪葛根湯高劑量組 8 11.38±4.28* 12.34±5.27 4.39±1.49*黃芪葛根湯中劑量組 4 11.52±1.39* 11.24±5.11* 4.51±1.60*黃芪葛根湯低劑量組 2 14.36±2.33 14.07±5.65 6.14±3.94羅格列酮組 0.001 8.84±0.65＊＊ 9.74±3.76＊＊ 3.09±1.04＊＊

2.3 黃芪葛根湯對(duì)大鼠血脂的影響 表2結(jié)果顯示，與模型組比較，黃芪葛根湯各劑量均可顯著降低模型大鼠的血清TC和LDL-C(P＜0.05～P＜0.01)，黃芪葛根湯高、中劑量還可顯著降低大鼠的TG水平 (P＜0.05)，中劑量明顯升高大鼠的HDL-C水平 (P＜0.05)。說明黃芪葛根湯具有良好的調(diào)血脂作用，有利于治療糖尿病的脂代謝紊亂。

表2 黃芪葛根湯對(duì)糖尿病心肌病大鼠血脂的影響Tab.2 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood lipid in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=8)

表2 黃芪葛根湯對(duì)糖尿病心肌病大鼠血脂的影響Tab.2 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood lipid in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=8)

與正常組比較，▲▲ P ＜0.01;與模型組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05。

組 別 劑量 /(g·kg-1) TC/(mmol·L-1) TG/(mmol·L-1) HDL-C/(mmol·L-1) LDL-C/(mmol·L-1)正常組 —1.05±0.17 0.65±0.11 0.58±0.03 0.20±0.04模型組 — 1.50±0.10▲▲ 1.50±0.37▲▲ 0.50±0.07▲▲ 0.27±0.04▲▲黃芪葛根湯高劑量組 8 1.24±0.22＊＊ 1.16±0.22* 0.53±0.16 0.19±0.05＊＊黃芪葛根湯中劑量組 4 1.13±0.16＊＊ 1.19±0.31* 0.59±0.13* 0.18±0.02＊＊黃芪葛根湯低劑量組 2 1.38±0.09* 1.22±0.31 0.51±0.13 0.17±0.03＊＊羅格列酮組 0.001 1.37±0.12＊＊ 0.91±0.16＊＊ 0.57±0.03* 0.22±0.05*

2.4 黃芪葛根湯對(duì)大鼠心肌SOD、MDA、GSH-Px的影響 表3結(jié)果表明，糖尿病心肌病模型組大鼠心肌SOD和GSH-Px活性顯著低于正常組，MDA顯著高于正常組 (P＜0.01)，提示大鼠心肌存在著過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)。而黃芪葛根湯高、中、低劑量組心肌SOD活性都明顯高于模型組，高、中劑量組心肌GSH-Px活性顯著高于模型組，MDA水平明顯低于模型組，提示黃芪葛根湯能明顯提高心肌的抗氧化能力。

表3 黃芪葛根湯對(duì)糖尿病心肌病大鼠SOD、MDA、GSH-Px的影響Tab.3 Effects of Huangqi Gegen Decoction on SOD，MDA and GSH-Px in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=9)

表3 黃芪葛根湯對(duì)糖尿病心肌病大鼠SOD、MDA、GSH-Px的影響Tab.3 Effects of Huangqi Gegen Decoction on SOD，MDA and GSH-Px in diabetic cardiomyopathy rats(±s，n=9)

與正常組比較，▲▲ P ＜0.01;與模型組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg-1) SOD/(U·mgprot-1) MDA/(nmol·mgprot-1) GSH-Px/(活力單位)正常組-80.85±19.63 3.09±0.46 56.65±9.72模型組 - 55.10±11.25▲▲ 3.77±0.36▲▲ 43.90±10.24▲▲黃芪葛根湯高劑量組 8 77.02±15.64＊＊ 3.23±0.55* 58.37±16.11*黃芪葛根湯中劑量組 4 76.88±9.52＊＊ 3.30±0.59* 57.92±6.94＊＊黃芪葛根湯低劑量組 2 69.90±12.37* 3.53±0.80 52.69±11.89羅格列酮組 0.001 71.58±17.37* 3.27±0.60* 58.47±10.01＊＊

2.5 黃芪葛根湯對(duì)大鼠心肌NF-κB mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果表明，糖尿病心肌病模型組大鼠的心肌NF-κB mRNA表達(dá)明顯高于正常組(P＜0.05)，而黃芪葛根湯高、中劑量組都能明顯抑制NF-κB mRNA的表達(dá) (P＜0.05)。(見圖1和圖2)

圖1 心肌NF-κB RT-PCR電泳圖Fig.1 Electrophoresis picture of NF-kappa B in myocardium detected by RT-PCR

圖2 心肌NF-κB mRNA表達(dá)比較Fig.2 Expression level of NF-kappa B in myocardium(±s，n=6)

3 討論

糖尿病是一種由多種原因引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂綜合征，這種代謝的紊亂可引起心肌細(xì)胞的能量代謝障礙，最終導(dǎo)致心臟功能和結(jié)構(gòu)的異常。目前糖尿病心肌病作為糖尿病的一種獨(dú)特的并發(fā)癥已經(jīng)得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的公認(rèn)［3-7］，但由于本病隱匿性較強(qiáng)，容易被漏診或誤診，因此一旦發(fā)現(xiàn)，病情嚴(yán)重復(fù)雜，治療矛盾多，預(yù)后較差，如果能在疾病的早期采取干預(yù)措施將對(duì)本病產(chǎn)生積極的影響。中藥黃芪、葛根對(duì)糖尿病、心血管疾病均有較好的治療效果，且二者作為藥對(duì)配伍應(yīng)用于糖尿病及并發(fā)癥的治療歷史悠久。為探討黃芪葛根湯對(duì)糖尿病心肌的保護(hù)作用，通過復(fù)合因素建立和臨床特征相似的2型糖尿病心肌病大鼠模型，已證實(shí)該模型具有明顯的多飲、多食、多尿、糖脂代謝紊亂以及糖尿病心肌病的典型病理特征為心肌細(xì)胞肥大、凋亡、灶性壞死，心肌間質(zhì)纖維化。本研究主要探討該方對(duì)糖尿病大鼠血糖、血脂、心肌氧化應(yīng)激和NF-κB表達(dá)的影響。

高血糖是糖尿病最基本的病理特征，也是引起糖尿病一些慢性并發(fā)癥的重要原因。脂質(zhì)代謝紊亂既可加重糖代謝紊亂，又可使糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生率及病死率明顯增高。因此，積極采取降糖降脂措施有利于2型糖尿病及其并發(fā)癥的治療。本研究證實(shí)，黃芪葛根湯能明顯降低大鼠空腹血糖和餐后血糖，而且具有良好的調(diào)節(jié)血脂作用，說明該方的長(zhǎng)期應(yīng)用將有利于代謝綜合征的防治。

2型糖尿病病人存在氧化應(yīng)激的增強(qiáng)已被國(guó)內(nèi)外許多研究證實(shí)，在持續(xù)高糖狀態(tài)下，ROS生成增加可能是糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。同時(shí)，異常的脂質(zhì)代謝所產(chǎn)生的具有毒性的氧化型LDL在體內(nèi)的大量蓄積，使細(xì)胞引起TNF-α和IL-6等增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，加重了心肌細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物(AGES)在微血管內(nèi)膜、周膜以及心肌間質(zhì)沉積并與膠原蛋白交聯(lián)導(dǎo)致纖維化。近年的研究表明，氧化應(yīng)激還與心肌細(xì)胞凋亡有著極其密切的關(guān)系。由此可知氧化應(yīng)激在糖尿病心肌病變過程中扮演著非常重要的角色。

在缺乏抗氧化物的有效補(bǔ)充的情況下，氧化應(yīng)激逐漸加重，進(jìn)一步導(dǎo)致各種相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的激活，包括NF-κB。NF-κB是一種廣泛存在于體內(nèi)多種細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，被稱為炎癥反應(yīng)鏈的“基因開關(guān)”，參與許多細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)、凋亡調(diào)控、免疫等方面發(fā)揮重要作用。糖尿病時(shí)蛋白質(zhì)的非酶糖化、AGES和其特異受體結(jié)合、氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS等均可激活NF-κB［8］，激活的 NF-κB 可啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄(TNF-α、TGF-β1 等)［9］。

本研究結(jié)果顯示，糖尿病心肌病模型大鼠心肌MDA顯著增高，SOD、GSH-Px活性顯著降低，證實(shí)了氧化應(yīng)激性損傷與糖尿病心肌病的發(fā)病關(guān)系密切，而且心肌組織NF-κB表達(dá)明顯增強(qiáng)。黃芪葛根湯能明顯增強(qiáng)心肌內(nèi)抗氧化酶活性及減少脂質(zhì)過氧化，抑制糖尿病心肌NF-κB表達(dá)，從而預(yù)防或延緩心肌病變的發(fā)生，對(duì)糖尿病心肌發(fā)揮保護(hù)作用。

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