朱慧明，魏 剛，張會(huì)欣，何奇龍，高學(xué)東，齊曉琳，王宏濤

糖尿病性視網(wǎng)膜病變 (DR)是糖尿病微血管病變中最重要的表現(xiàn)，同時(shí)也是糖尿病并發(fā)癥在眼部的主要表現(xiàn)［1］。研究表明，高糖狀態(tài)下生長(zhǎng)因子在眼內(nèi)新生血管形成過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，并且能夠引起視網(wǎng)膜微血管滲透性的改變，造成視網(wǎng)膜屏障的破壞，同時(shí)能夠誘導(dǎo)血管生成素生成增加，造成視力損壞。芪黃明目膠囊在DR臨床研究中取得了很好的療效［2］，但其機(jī)制尚不明確。故本研究以自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj－Ay小鼠為模型，觀察芪黃明目膠囊對(duì)DR小鼠視網(wǎng)膜生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響，探討其機(jī)制，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KK/Upj－Ay小鼠 (自發(fā)性2型糖尿病小鼠，用專(zhuān)用飼料喂養(yǎng)3個(gè)月即可造模成DR小鼠)36只，體質(zhì)量30～40 g;C57BL/6小鼠9只，體質(zhì)量25～30 g。均為SPF級(jí)，雄性，12周齡，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào):0225144。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物屏障系統(tǒng)。

1.1.2 試劑與儀器 芪黃明目膠囊，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF)、色素上皮衍生因子 (PEDF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β(TGF－β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子－Ⅰ (IGF－Ⅰ)引物由上海生工生物技術(shù)公司合成;VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ一抗購(gòu)自Santa Cruz公司。熒光定量 PCR儀，ABI公司產(chǎn)品;凝膠成像分析儀，Biorad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥 36只KK/Upj－Ay小鼠按空腹血糖(FBG)水平隨機(jī)分為模型組、芪黃明目膠囊高劑量組 (8.32 g生藥/kg)、芪黃明目膠囊中劑量組 (4.16 g生藥/kg)、芪黃明目膠囊低劑量組 (2.08 g生藥/kg)，另設(shè)C57BL/6小鼠為對(duì)照組，每組9只。采用灌胃給藥，芪黃明目膠囊各組按照相應(yīng)的劑量給予芪黃明目膠囊，對(duì)照組和模型組給予等體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)3個(gè)月。

1.2.2 小鼠視網(wǎng)膜消化鋪片標(biāo)本制備 連續(xù)給藥3個(gè)月后，把小鼠麻醉，取眼球，固定于10%甲醛液中48 h，分離視網(wǎng)膜，自來(lái)水漂洗，放入3%胰蛋白酶消化液37℃孵箱中消化振蕩約3 h，僅剩下一層透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，進(jìn)行HE－PAS染色。

1.2.3 Real Time PCR(qPCR)方法測(cè)定 VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ mRNA的表達(dá) 取視網(wǎng)膜組織，常規(guī)方法提取RNA，進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參照。VEGF引物:上游:5'－TGTCTATCAAGGGAGTGTGTGC－3'，下游:5'－TGGAGTATTTCCGTGACCG －3'，產(chǎn)物片段150 bp;bFGF引物:上游:5'－CGTCAAACTACAACTCCAAGCA －3'，下游:5'－CGTCCATCTTCCTTCATAGCA －3'，產(chǎn)物片段 93 bp;PEDF引物:上游:5'－TGGGTAACCAAGTTTGACTCG －3'，下游:5'－AAGCCGTATCGTAAGATGGC－3'，產(chǎn)物片段116 bp;TGF－β引物:上游:5'－CCGCAACAACGCCATCTATG －3'，下游:5'－TGCTTCCCGAATGTCTGACG－3'，產(chǎn)物片段85 bp;IGF－Ⅰ引物:上游:5'－CTCTTCAGTTCGTGTGTGGAC－3'，下游:5'－AATGCTGGAGCCATAGCCT－3'，產(chǎn)物片段68 bp;GAPDH引物:上游:5'－TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC －3'，下游:5'－TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC－3'，產(chǎn)物片段143 bp。最終結(jié)果計(jì)為與對(duì)照組進(jìn)行比較后的相對(duì)定量值，對(duì)照組設(shè)置為1。

1.2.4 Western blot法檢測(cè) VEGF、bFGF、PEDF、TGF － β、IGF－Ⅰ蛋白的表達(dá) 取視網(wǎng)膜組織，常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，化學(xué)發(fā)光法顯色，對(duì)條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。GAPDH作為內(nèi)參照。用目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以 (±s)表示，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計(jì)分析和Dunnet t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜消化鋪片形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組正常小鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管分布規(guī)則，走向較直，管徑粗細(xì)均勻一致;模型組小鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管網(wǎng)排列紊亂，走向極不規(guī)則，多根毛細(xì)血管扭聚成叢，部分毛細(xì)血管擴(kuò)張、管腔粗細(xì)不均;芪黃明目膠囊能明顯改善上述變化，以芪黃明目膠囊高劑組最為明顯。

2.2 視網(wǎng)膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ mRNA表達(dá)的變化 模型組小鼠視網(wǎng)膜 VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA表達(dá)與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。與模型組比較，芪黃明目膠囊中、高劑量組小鼠VEGF、IGF－Ⅰ mRNA表達(dá)顯著減少，芪黃明目膠囊高劑量組小鼠TGF－β mRNA表達(dá)顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);而芪黃明目膠囊低、中、高劑量組小鼠bFGF、PEDF mRNA表達(dá)與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表1、圖1)。

2.3 視網(wǎng)膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ蛋白表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果顯示，模型組小鼠視網(wǎng)膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。與模型組比較，芪黃明目膠囊中、高劑組小鼠視網(wǎng)膜VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ蛋白表達(dá)量顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);而bFGF和PEDF蛋白表達(dá)量與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見(jiàn)表2、圖2)。

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA表達(dá)比較 (±s)Table 1 Comparison of the mRNA expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA表達(dá)比較 (±s)Table 1 Comparison of the mRNA expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.05，★P＜0.01;VEGF=血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，bFGF=堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，PEDF=色素上皮洐生因子，TGF－β=轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β，IGF－Ⅰ=胰島素樣生長(zhǎng)因子－Ⅰ

組別 只數(shù) VEGF bFGF PEDF TGF－β IGF－Ⅰ對(duì)照組 3 1.05±0.15 1.51±0.44 1.14±0.16 0.90±0.14 1.54±0.47模型組 3 5.89±1.04△ 4.69±0.56△ 0.28±0.06△ 4.32±0.81△ 5.13±0.58△芪黃明目膠囊低劑組 3 4.23±0.83△ 4.79±1.11* 0.23±0.06△ 3.71±0.40△ 3.44±0.95*芪黃明目膠囊中劑組 3 2.48±0.43★ 5.41±1.49△ 0.29±0.09△ 2.86±0.71△ 2.50±0.85☆芪黃明目膠囊高劑組 3 2.54±0.64★ 4.06±1.23* 0.25±0.09△ 1.96±0.47☆ 2.36±0.78★F 0.000 0.014 0.000 0.000 0.002 21.638 5.459 49.154 17.837 10.065 P值值

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ 蛋白表達(dá)的比較 (±s)Table 2 Compariosn of the protein expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ 蛋白表達(dá)的比較 (±s)Table 2 Compariosn of the protein expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.05，★P＜0.01

組別 只數(shù) VEGF bFGF PEDF TGF－β IGF－Ⅰ對(duì)照組 3 0.16±0.04 0.12±0.03 0.84±0.12 0.14±0.06 0.16±0.04模型組 3 0.79±0.12△ 0.61±0.08△ 0.34±0.05△ 0.71±0.11△ 0.69±0.11△芪黃明目膠囊低劑組 3 0.65±0.09△ 0.66±0.06△ 0.36±0.06△ 0.63±0.10△ 0.61±0.08△芪黃明目膠囊中劑組 3 0.48±0.07△★ 0.64±0.11△ 0.34±0.07△ 0.49±0.08△☆ 0.44±0.08△★芪黃明目膠囊高劑組 3 0.36±0.06＊★ 0.59±0.09△ 0.32±0.06△ 0.42±0.07△★ 0.33±0.05△★F 值0.000 0.014 0.000 0.000 0.000 27.593 25.447 26.652 20.485 23.251 P值

圖1 各組熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)Figure 1 Amplification curve of real－time fluorescent quantitative PCR of each groups

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜Western blot結(jié)果Figure 2 Results of Western blot of each group

3 討論

許多因素，如血糖、血壓等對(duì)DR的發(fā)生發(fā)展均有重要作用［3］，其發(fā)病機(jī)制盡管尚未明確，但隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)在DR發(fā)病機(jī)制方面的深入研究，已證實(shí)VEGF、bFGF、TGF－β、IGF－Ⅰ、PEDF等細(xì)胞因子通過(guò)一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)共同參與了DR的發(fā)生發(fā)展。其中，正常情況下視網(wǎng)膜細(xì)胞可產(chǎn)生較低水平的VEGF，用以維持血管穩(wěn)定性和視網(wǎng)膜正常發(fā)育，高血糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜局部缺氧導(dǎo)致VEGF表達(dá)上調(diào)，強(qiáng)力促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性及誘導(dǎo)新生血管生成，在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4－5］。TGF－β眼內(nèi)來(lái)源廣泛，DR患者血清中TGF－β水平明顯高于健康人群，并隨病程的延長(zhǎng)及眼部病情的加重而增高［6］，可能是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生、黏附及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、激活絲裂原活化蛋白激酶、增加纖維連接蛋白的合成而參與了DR的形成。IGF－Ⅰ是一種多功能細(xì)胞增生調(diào)控因子，是眼組織正常發(fā)育并完成其生理功能所必需的重要因子，但在糖尿病條件下，IGF網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的作用明顯增強(qiáng)［7］，可以促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的形成。本研究結(jié)果顯示，自發(fā)性2型糖尿病小鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管網(wǎng)排列紊亂，走向極不規(guī)則，多根毛細(xì)血管扭聚成叢，部分毛細(xì)血管擴(kuò)張、管腔粗細(xì)不均，提示6個(gè)月的KK/Upj－Ay小鼠發(fā)生了DR，采用qPCR和Western blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)DR小鼠視網(wǎng)膜VEGF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4－7］。芪黃明目膠囊治療3個(gè)月后能明顯改善視網(wǎng)膜損傷，延緩視網(wǎng)膜病變的發(fā)展，顯著降低DR小鼠VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ mRNA和蛋白水平，提示芪黃明目膠囊治療DR與下調(diào)VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ表達(dá)有關(guān)。

同時(shí)本研究檢測(cè)了DR小鼠bFGF和PEDF的表達(dá)。bFGF促進(jìn)DR發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為bFGF可通過(guò)旁分泌途徑和自分泌途徑作用于視網(wǎng)膜的各層細(xì)胞，并促進(jìn)其他生長(zhǎng)因子的分泌，因而與DR密切相關(guān)［8］。PEDF被認(rèn)為是最有效的天然血管抑制因子，在減少血管滲漏和新生血管形成等病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，研究表明在DR的早、中、晚期PEDF的保護(hù)性作用持續(xù)存在［9］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠視網(wǎng)膜bFGF表達(dá)較正常小鼠顯著升高，PEDF表達(dá)顯著降低，芪黃明目膠囊各組bFGF、PEDF表達(dá)與模型組比較無(wú)顯著差異，提示芪黃明目膠囊對(duì)DR的作用與bFGF、PEDF途徑無(wú)關(guān)。

芪黃明目膠囊為中藥復(fù)方制劑，以化瘀通絡(luò)為前提，配合滋潤(rùn)通補(bǔ)、補(bǔ)氣通絡(luò)、熄風(fēng)解痙、解毒通絡(luò)諸法，從絡(luò)論治DR的復(fù)方中藥，在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中顯示了很好的效果，同時(shí)還具有降糖的作用［2］?？傊吸S明目膠囊對(duì)2型糖尿病小鼠視網(wǎng)膜發(fā)揮保護(hù)作用，可能與其下調(diào) VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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