王 艷，劉 蔚，王 征

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種與遺傳因素相關(guān)聯(lián)的全身慢性分泌代謝疾病，表現(xiàn)為體內(nèi)胰島素的絕對或相對不足而引起糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝紊亂。糖尿病分為1型與2型，1型糖尿?。―M1）由胰島素絕對不足引起，2型糖尿?。―M2）是指以胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗為主要病理生理基礎(chǔ)和顯著特征，導致體內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂的一類糖尿病[1]。而2型糖尿病是糖尿病人群的主體，占糖尿病發(fā)病率的90%以上。因此，建立2型糖尿病的動物模型，用以研究2型糖尿病致病機理及篩選治療2型糖尿病藥物具有極其重要的意義。試驗采用高糖高脂飲食，再結(jié)合鏈脲佐菌素（STZ，35 mg/kg）腹腔注射，在較短時間內(nèi)成功構(gòu)建了T2DM SD大鼠模型，并連續(xù)監(jiān)測該模型大鼠動態(tài)血糖的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和材料

雌性SD大鼠20只，SPF級，4周齡，體重100～130 g（湖南斯萊克景達公司，合格證號：HNASLKJ20101790）；高脂飼料配方[2]：普通飼料68.5%、豬油10%、蔗糖20%、豬膽鹽0.5%、膽固醇1%（中南大學湘雅附一）；STZ（美國sigma公司），大鼠ELISA試劑盒（美國RD進口分裝），羅康全優(yōu)越型血糖試紙（德國羅氏診斷公司）。

1.2 方法

1.2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立 實驗性2型糖尿病模型參考袁瓊等[2]、施紅[3]、李雅晶等[4]的方法略加改進。SD大鼠20只，動物房飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，室溫控制在20～24℃，明暗周期12 h。 適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組（NC，n=8）和2型糖尿病模型組（DM，n=12）。試驗期間，對照組飼以普通飼料，模形組飼以高脂飼料。4周后，所有大鼠禁食12 h，模形組以小劑量鏈脲佐菌素（STZ，35 mg/kg）腹腔注射，72 h后測定空腹血糖，選擇FBG≥11.1 mmol/L為2型糖尿病模型的合格標準[3]。對照組腹腔注射等體積檸檬酸鈉+檸檬酸鈉緩沖液，并連續(xù)3周監(jiān)測2型糖尿病大鼠空腹血糖的動態(tài)變化。

1.2.2 口服糖耐量試驗 大鼠禁食過夜，單次灌胃葡萄糖 2.5 g/kg，分別在 0、0.5、1.0、2 h 尾靜脈取血檢測血糖。

1.2.3 血清胰島素（FINS）檢測 試驗結(jié)束時，大鼠過夜禁食12 h，次日上午眼球取血，3000 r/min離心10 min，取上清血測空腹血糖（FBG）及空腹胰島素（FINS），F(xiàn)INS用ELISA試劑盒測，并計算各自胰島素敏感指數(shù)ISI=Ln[1/FBG×FINS]及胰島素抵抗指數(shù) HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5

1.2.4 大鼠胰腺組織形態(tài)學檢測 8周后采用眼球取血將全部大鼠處死，立即解剖取胰腺組織，以10%中性的甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間差異比較采用t檢驗。p<0.05，表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 糖耐量試驗結(jié)果

糖耐量試驗表明，試驗以第8周未時，灌胃葡萄糖并分別于0、0.5、1、2 h后取樣測定血糖，與對照組相比，模型組血糖顯著高于對照組，且均具有極顯著性差異（圖1）。

圖1 糖耐量試驗

2.2 腹腔注射STZ后FBG的變化

由圖2可知，整體來看，模型組FBG程上升趨勢，注射STZ 17 d后，血糖含量基本穩(wěn)定，這說明該模型FBG相對保持穩(wěn)定。且在注射STZ 3、10、17 d后FBG極顯著高于對照組，

圖2 腹腔注射STZ后FBG的變化

2.3 2型糖尿病大鼠胰島素敏感性變化

由表1可知，與對照組相比，模型組的胰島素和胰島素抵抗指數(shù)顯著增加（p<0.01），胰島素敏感指數(shù)顯著下降（p<0.01），這說明了模型組大鼠產(chǎn)生了胰島素抵抗。

表1

2.4 2型糖尿病大鼠的成模率

12只用于造模的SD大鼠，有10只大鼠FBG≥11.1 mmol/L，成模率為83.3%。

2.5 大鼠胰腺組織形態(tài)的變化

從圖3、圖4中可以看出，與對照組相比，模型組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)散亂，胰島細胞數(shù)目減少伴萎縮，胰腺胰島細胞核不清晰，核質(zhì)顏色變淡，胰島內(nèi)β細胞有嚴重的脫顆粒現(xiàn)象，少數(shù)細胞塌陷、缺失，排列不規(guī)則。

圖3 對照組胰腺組織（HE×400）

圖4 模型組胰腺組織（HE×400）

3 討論

胰島素抵抗（IR）是T2DM發(fā)病機制的基本環(huán)節(jié)和其代射疾病的生理基礎(chǔ)，表現(xiàn)為胰島素敏感性下降和胰島素抵抗增加，很多研究表明，高脂飲食是胰島素抵抗和T2DM發(fā)生的重要因素[5-6]，STZ注射和高糖高脂喂養(yǎng)是形成T2DM模型的重要條件，所以在同時進行小劑量注射STZ造成的胰島β細胞輕度損傷的情況下，使多數(shù)動物產(chǎn)生糖耐量異常，再繼續(xù)飼以高糖高脂飼料，進而復制出T2DM大鼠模型。STZ誘導的糖尿病因給藥方式、劑量不同，其成模效果也有所差別，STZ注射劑量15～50 mg/kg均有報道[7]，造成較大差別的原因很多，但最有可能的是高糖高脂喂養(yǎng)的時間，喂養(yǎng)的時間越長，所需的STZ劑量就越少[8]，如高脂4周時，袁瓊等所用的劑量是35 mg/kg[2]，兩周高脂飼養(yǎng)時，REED所用的STZ劑量為50 mg/kg[9]。雖然理論上高脂高糖飼養(yǎng)時間長短與STZ劑量大小關(guān)系很大，但考慮到動物的年齡以及造模后續(xù)的試驗還需要一定的時間，因此，建議高脂高糖飼養(yǎng)時間4周左右為宜。另一個重要的原因是STZ的給藥途徑，有研究表明腹腔注射與尾靜脈注射兩種途徑在誘導試驗性糖尿病動物模型無顯著差異[10]，因此選用35 mg/kg的STZ腹腔注射，對SD大鼠進行研究。

從試驗結(jié)果看，STZ注射后動物血糖升高，糖耐量異常；從胰島病理改變觀察看到胰島細胞數(shù)目減少伴萎縮，從而導致胰島素敏感性下降，使動物產(chǎn)生T2DM，說明此建模方法是成功的。

為了證實成模后T2DM模型大鼠FBG的穩(wěn)定性，又連續(xù)監(jiān)測STZ注射后17 d其血糖動態(tài)變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T2DM模型大鼠FBG在STZ注射后10 d內(nèi)具有波動性。但STZ注射17 d后FBG基本趨于穩(wěn)定。

試驗證實，該模型發(fā)病過程類似人類T2DM。該實驗操作方法簡便、周期短、注射STZ量少，減少對動物的損傷和節(jié)約成本，高血糖形成較快、成模率較高，且成模后17 d內(nèi)大鼠FBG的穩(wěn)定性較好。因此，該方法構(gòu)建的T2DM動物模型可以很好地應用于各種相關(guān)的糖尿病試驗研究。

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