劉含亮 孫敏敏 王紅衛(wèi) 萬文菊 王紀亭*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271000;2.泰山醫(yī)學院，泰安 271000)

開發(fā)利用具有無污染、無殘留、不產(chǎn)生耐藥性特點，同時可提高動物機體抵抗能力，預防動物疾病的綠色環(huán)保型促生長飼料添加劑已經(jīng)成為飼料業(yè)發(fā)展的必然趨勢。素有“人體第六生命要素”、“軟黃金”之美譽的甲殼素(又稱幾丁質(zhì))廣泛存在于海產(chǎn)品和絲狀菌類中，但由于其不溶于水，在開發(fā)應(yīng)用上受到了很大的限制。殼寡糖(又稱寡聚氨基葡糖、甲殼低聚糖)由甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物殼聚糖降解獲得，是由2～10個氨基葡萄糖通過β－1，4－糖苷鍵連接而成的低聚糖［1］。殼寡糖是天然糖中唯一大量存在的帶正電荷的堿性氨基多糖，水溶性好，可通過動物腸道上皮細胞直接被吸收。殼寡糖以功能性食品形式早已應(yīng)用于食品工業(yè)中，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中也被作為新型的飼料添加劑廣泛運用。王秀武等［2］報道，殼寡糖可抑制肉仔雞腸道有害菌的增殖，促進微絨毛生長發(fā)育，提高免疫能力和生產(chǎn)性能。馬利等［3］研究表明，飼料中添加殼寡糖能夠促進南美白對蝦的生長，降低機體脂肪和膽固醇沉積，維護各個器官功能的正常。雖然水產(chǎn)飼料中添加殼寡糖并運用于養(yǎng)殖過程的已有較多報道，但大多都局限于促生長效果的研究。作為低等的脊椎動物，魚類主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)來抵抗病原的入侵［4］，非特異性免疫防御機制是魚類抵抗病原的第1道屏障。本試驗通過在飼料中添加不同劑量的殼寡糖，研究其對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)生長性能、血清生化指標和非特異性免疫功能的影響，旨在為殼寡糖在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用殼寡糖(脫乙酰度＞90%)購自濟南海得貝生物工程有限公司，以水產(chǎn)動物甲殼為原料，采用酶法制備，分子質(zhì)量為3 000 u。

1.2 試驗飼料

以小麥、豆粕、魚粉為主要原料，按照 NRC(1993)魚類營養(yǎng)標準配制基礎(chǔ)飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對照組)、100、200和400 mg/kg的殼寡糖，配制成4種試驗飼料。飼料原料經(jīng)粉碎(40目以上)后加水擠壓成粒徑為1.5～2.5 mm的顆粒料，自然晾干后備用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(air－dry basis) %

1)預混料為每千克飼料提供 Premix provided the following per kg of diet:VC 800 mg，VA 12 000 IU，VD33 000 IU，VE 80 mg，VK 7 mg，VB120 mg，VB240 mg，VB620 mg，VB120.8 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 60 mg，煙酸 nicotinic acid 215 mg，葉酸 folic acid 10 mg，肌醇 inositol 1 200 mg，生物素 biotin 3.0 mg，氯化膽堿 choline chloride 2 g，抗氧化劑 antioxidant 200 mg，甜菜堿 betaine 1.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 100 mg，CuSO4·5H2O 20 mg，MnSO4·H2O 67 mg，KI 0.59 mg，MgSO4·7H2O 9.28 g。

2)計算值 Calculated values。

1.3 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

選用體重約為60 g的虹鱒480尾，隨機分為4組(每組4個重復，每個重復30尾)，分別飼喂在基礎(chǔ)飼料中添加0、100、200和400 mg/kg殼寡糖的試驗飼料。試驗魚以重復為單位放養(yǎng)于水族箱中，水族箱的規(guī)格為0.30 m3，水體積為0.25 m3。

按照常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進行，試驗開始前用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)1周，日投喂量為試驗魚體重的2% ～4%，每天分別在09:00、14:00各投喂1次，根據(jù)攝食情況適當調(diào)整投喂量。試驗期間水溫為(15.5±2.0)℃，溶氧為(8.2±1.1)mg/L。試驗期為49 d。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長性能

特定生長率(specific growth rate，SGR，%/d)=

100×［ln初重－ln末重］/試驗天數(shù);增重率(weight gain rate，WGR，%)=

100×(初重－末重)/初重;

飼料系數(shù)(feed conversion rate，F(xiàn)CR)=

(投料量－殘料量)/(死亡個體重+末重－初重);蛋白質(zhì)效率(protein efficiency rate，PER，%)=100×魚體凈增重/(飼料攝取量×蛋白質(zhì)含量)。1.4.2 血清生化指標

試驗結(jié)束次日，每重復隨機取4尾魚，從尾靜脈采血，室溫放置60 min后，3 000 r/min離心10 min，將4尾魚的離心上清液混合，制備待測血清樣。血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、甘油三酯、膽固醇含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.4.3 非特異性免疫指標

1.4.3.1 白細胞吞噬能力的測定

參照王軍等［5］的方法進行，具體操作如下:1)每重復隨機取4尾魚，用無菌注射器從尾動脈采血適量，將每個重復4尾魚所采的血液混合成1個樣品，立即吸取2滴于盛有0.02 mL肝素(0.5%)的潔凈凹玻片的凹孔內(nèi)，輕輕攪動混勻;2)用滴管加1滴金黃色葡萄球菌菌液(濃度為6×108個/mL)于凹孔內(nèi)，充分混勻;3)將凹玻片置于有數(shù)層濕紗布的預溫帶蓋容器內(nèi)，37℃溫育30 min;4)以2 000 r/min離心10 min，吸取血漿與紅細胞交界面的白細胞做血涂片，每個血樣做2張涂片，自然晾干;5)滴加甲醇固定3～4 min，用水沖洗后自然晾干;6)用姬姆薩染色2～3 min，用水沖洗后自然晾干;7)將制備好的血涂片置于顯微鏡油鏡下觀察，隨機計數(shù)100個多形核白細胞中吞噬有細菌的細胞數(shù)，即為吞噬百分率(%)，再數(shù)此100個多形核白細胞中所吞噬的細菌總數(shù)，除以100，得出每個細胞吞噬細菌數(shù)的平均值，即為吞噬指數(shù)。

1.4.3.2 血清殺菌能力的測定

參照 Rainger等［6］、Ourth 等［7］及秦啟偉等［8］的方法進行，具體操作如下:1)每重復隨機取4尾魚，用無菌注射器從尾動脈采血適量，將每個重復4尾魚所采的血液混合成1個樣品，血液經(jīng)1 000 r/min離心5 min，制備血清;2)將創(chuàng)傷弧菌28℃培養(yǎng)24 h后，用0.85%氯化鈉溶液洗滌并調(diào)整細菌濃度至1×106個/mL;3)取200 μL新鮮血清混合于200 μL細菌懸液中，28℃下溫育1 h;4)取細菌和血清混合物培養(yǎng)于溫熱的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)平板中，28℃下培養(yǎng)24 h后計算平板中菌落形成單位(colony forming units，CFUs);5)以0.85%NaCl溶液作為對照，計算血清的殺菌百分率。

血清的殺菌百分率計算公式如下:殺菌百分率(%)=100×(1－試驗平板中菌落

形成單位/對照平板中菌落形成單位)。

1.4.3.3 血清、肝臟和鰓中溶菌酶活性的測定

參照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒的說明書進行，具體操作如下:1)血清制備。每個重復選取3尾魚，用無菌注射器從心臟采血，放于4℃靜置4 h，然后4 000 r/min離心10 min，取上清液用于測定溶菌酶活性。2)肝臟、鰓組織勻漿液制備。分別取試驗魚肝、鰓組織各5 g，置于平皿中，剪碎后置于勻漿器中并加入1倍體積的0.1 mol/L磷酸鉀鹽緩沖液，充分勻漿且反復凍融數(shù)次后勻漿液經(jīng)5 000 r/min離心15 min，取上清液用于測定溶菌酶活性。3)采用比濁法測定溶菌酶活性。

樣品中溶菌酶活性的計算公式如下:溶菌酶活性(U/mL或U/g)=［(樣品Tt值－樣品To值)/(標準品Tt值－標準品To值)］×

標準品濃度。

式中:Tt值為At值(340 nm下5 min后的吸光度值)換算出的透光度值;To值為Ao值(340 nm下初始時的吸光度值)換算出的透光度值。

1.4.4 體成分

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每重復隨機取3尾魚，測定全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量。全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量分別采用恒溫烘干失水法、微量凱氏定氮法、索氏抽提法和高溫灼燒法測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SPSS 13.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計學分析，組間若有顯著差異，則進行Duncan氏多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對虹鱒生長性能的影響

由表 2可知，與對照組相比，100、200和400 mg/kg殼寡糖組的特定生長率分別提高了5.60%(P ＜0.05)、15.89%(P ＜0.05)和18.69%(P＜0.05)，增重率分別提高了7.53%(P＜0.05)、21.21%(P＜0.05)和 26.02%(P＜0.05)，蛋白質(zhì)效率分別提高了0.60%(P＞0.05)、7.02%(P ＞0.05)和9.79%(P ＜0.05)，飼料系數(shù)分別降低了0.60%(P＞0.05)、6.55%(P＞0.05)和8.93%(P＜0.05)。200和400 mg/kg殼寡糖組的特定生長率、增重率、飼料系數(shù)和蛋白質(zhì)效率均差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 殼寡糖對虹鱒血清生化指標的影響

由表3可知，虹鱒飼料中添加殼寡糖提高了血清總蛋白、白蛋白、球蛋白含量，降低了血清膽固醇、甘油三酯、葡萄糖含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，但均未達到顯著水平(P＞0.05)。

2.3 殼寡糖對虹鱒非特異性免疫功能的影響

2.3.1 殼寡糖對虹鱒白細胞吞噬能力的影響

由表4可知，200和400 mg/kg殼寡糖組較對照組和100 mg/kg殼寡糖組顯著提高了白細胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)(P＜0.05)，但200和400 mg/kg殼寡糖組之間差異不顯著(P＞0.05)，100 mg/kg殼寡糖組與對照組之間差異也不顯著(P＞0.05)。

2.3.2 殼寡糖對虹鱒血清殺菌能力的影響

由表5可知，血清殺菌百分率隨殼寡糖添加水平的增加而提高，200和400 mg/kg殼寡糖組極顯著高于對照組和100 mg/kg殼寡糖組(P＜0.01)，100 mg/kg殼寡糖組極顯著高于對照組(P＜0.01)，但200和400 mg/kg殼寡糖組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表2 殼寡糖對虹鱒生長性能的影響Table 2 Effects of chito－oligosaccharides on growth performance of rainbow trout

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)。下表同。

In the same row，values with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，and with different capital letter superscripts mean significant difference(P＜0.01).The same as below.

表3 殼寡糖對虹鱒血清生化指標的影響Table 3 Effects of chito－oligosaccharides on serum biochemical indices of rainbow trout

表4 殼寡糖對虹鱒白細胞吞噬能力的影響Table 4 Effects of chito－oligosaccharides on leucocyte phagocytic ability of rainbow trout

表5 殼寡糖對虹鱒血清殺菌能力的影響Table 5 Effects of chito－oligosaccharides on serum bactericidal ability of rainbow trout%

2.3.3 殼寡糖對虹鱒血清、肝臟和鰓中溶菌酶活性的影響

由表6可知，200和400 mg/kg殼寡糖組較對照組和100 mg/kg殼寡糖組顯著提高了血清和肝臟中溶菌酶活性(P＜0.05)，但200和400 mg/kg殼寡糖組之間差異不顯著(P＞0.05)，100 mg/kg殼寡糖組與對照組之間差異也不顯著(P＞0.05)。隨著殼寡糖添加水平的增加，鰓中溶菌酶活性顯著增加(P＜0.05)。

表6 殼寡糖對虹鱒血清、肝臟和鰓中溶菌酶活性的影響Table 6 Effects of chito－oligosaccharides on lysozyme activity in serum，liver and gill of rainbow trout

2.4 殼寡糖對虹鱒體成分的影響

由表7可知，殼寡糖對虹鱒全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分含量均沒有顯著影響(P＞0.05)。

表7 殼寡糖對虹鱒體成分的影響Table 7 Effects of chito－oligosaccharides on body composition of rainbow trout %

3 討論

3.1 殼寡糖對虹鱒生長性能的影響

Refstie等［9］給大西洋鮭魚分別飼喂不含和含大豆寡糖的飼料55 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂含大豆寡糖飼料的試驗組大西洋鮭魚在增重率、飼料轉(zhuǎn)化率以及蛋白質(zhì)和脂肪消化率等方面均優(yōu)于對照組。劉興國等［10］在羅非魚的飼料中分別添加0.25%、0.50%、1.00%、2.00%的殼聚糖(甲殼素酶解所得，分子質(zhì)量大于殼寡糖)，結(jié)果表明，殼聚糖顯著降低了羅非魚的飼料系數(shù)，提高了蛋白質(zhì)效率，添加量以0.50%最為適宜。曹丹等［11］在異育銀鯽飼料中分別添加0、1.0%、1.5%、2.0%的殼聚糖，飼喂60 d后發(fā)現(xiàn)，各試驗組的增重率均比對照組顯著提高，且以1.0%添加組提高最多。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加100、200和400 mg/kg殼寡糖均提高了虹鱒的特定生長率、增重率和蛋白質(zhì)效率，降低了飼料系數(shù)，表明飼料中添加殼寡糖對虹鱒的生長有良好的促進作用。寡糖主要通過以下途徑對動物的生長性能產(chǎn)生影響:1)促進礦物元素的吸收。寡糖發(fā)酵產(chǎn)生的酸性物質(zhì)能吸附鈣化合物使其溶解性增加，從而導致鈣吸收能力增強。2)生成營養(yǎng)物質(zhì)。寡糖可促進有益菌如雙歧桿菌等的大量增殖，而雙歧桿菌在腸道能合成維生素 B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素 B12、煙酸、葉酸以及各種氨基酸［12］。

3.2 殼寡糖對虹鱒血清生化指標的影響

寡糖能夠降低血清中甘油三酯和膽固醇含量，進而改善脂類代謝;能夠降低血清中的尿素氮含量，提高蛋白質(zhì)沉積率;同時還能夠降低尿素在腎臟中的沉積，從而減少腎臟尿素中毒的可能性。此外，寡糖的添加還對血清中的免疫球蛋白含量、生長激素水平以及谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性等有一定的影響。血清轉(zhuǎn)氨酶在氨基酸代謝和蛋白質(zhì)、脂肪和糖三者相互轉(zhuǎn)化的過程中起著極其重要的作用，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的升高常反映肝功能發(fā)生障礙，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的升高常反映心臟或肌肉組織功能發(fā)生障礙［13］;血清葡萄糖含量可作為機體營養(yǎng)狀況的指標，含量較高時表現(xiàn)為魚類積極攝食，健康狀態(tài)良好。這些血清生化指標的變化可直接或間接地反映出殼寡糖投喂后對魚類生長、代謝的影響。馬利等［3］在南美白對蝦飼料 中 分 別 添 加 殼 寡 糖 0、125、250、500、1 000 mg/kg，飼喂8周后發(fā)現(xiàn)，殼寡糖對南美白對蝦血清中肌酐、葡萄糖、鈣離子、總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇含量均無顯著影響，但可使高密度脂蛋白膽固醇含量顯著增加，促進脂類代謝。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加殼寡糖提高了虹鱒血清總蛋白、白蛋白、球蛋白的含量，降低了血清甘油三酯、膽固醇、葡萄糖含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，但均未達到顯著水平，說明殼寡糖提高了飼料蛋白質(zhì)在體內(nèi)的沉積，同時也體現(xiàn)了虹鱒魚體的健康水平。

3.3 殼寡糖對虹鱒非特異性免疫功能的影響

魚類是較低等的脊椎動物，非特異免疫在魚類的免疫防御中發(fā)揮著重要作用。魚類抗傳染免疫中主要靠體液免疫和細胞免疫，在細胞免疫中，血液中的白細胞起著重要的作用。血清溶菌酶活性是魚類機體非特異性免疫反應(yīng)的重要指標，其活性的升高表明巨噬細胞、多型核白細胞的吞噬活性加強。因此，通過測定魚類血液中白細胞數(shù)量和吞噬能力以及肝臟等組織中的溶菌酶活性，可以反映出被測魚類機體的免疫狀態(tài)。本研究結(jié)果表明，飼料中添加200和400 mg/kg殼寡糖后虹鱒的非特異性免疫功能得到顯著改善。Claire等［14］將健康鯉魚飼養(yǎng)于殼聚糖濃度為150 mg/L的水中作為試驗組，正常飼養(yǎng)96 h后采集鯉魚的肝臟、頭腎組織，測其抗體水平，發(fā)現(xiàn)試驗組的總抗體量顯著高于對照組;此外，將寄生有Ptychobothrium sp.(Cestoda)的鯉魚飼養(yǎng)于殼聚糖和銅離子濃度分別為75.0和0.1 mg/L的水中作為試驗組，檢測結(jié)果仍是試驗組的總抗體量顯著高于對照組。王樹芹等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在異育銀鯽飼料中添加0.5%或1.0%的殼聚糖能夠提高血清溶菌酶活性和白細胞的吞噬能力。沈錦玉等［16］研究發(fā)現(xiàn)，給中華絨螯蟹注射或口服殼聚糖可顯著提高其血清中溶菌酶、超氧化物歧化酶活性。寡糖提高機體免疫功能的可能機制有:1)寡糖本身具有一定的免疫原性，能夠刺激機體免疫應(yīng)答［17］;2)寡糖分子與存在于腸內(nèi)皮細胞上的有害微生物的受體結(jié)構(gòu)相似，能與一定的毒素、病毒和真菌細胞的表面結(jié)合，可作為外源抗原的佐劑減緩抗原的吸收，增加抗原的效價，從而增強動物體的細胞和體液免疫反應(yīng)［18］;3)寡糖可促進有益菌如雙歧桿菌等的大量增殖，而雙歧桿菌可以提高機體的抗體水平，激活巨噬細胞的吞噬活性，從而影響機體的免疫功能［19］。

4 結(jié)論

本試驗條件下，飼料中添加殼寡糖可提高虹鱒的生長性能和非特異性免疫功能，建議添加量為200 mg/kg。

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