薛維納，彭巖波，陳陽(yáng)

(1.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101;2.山東省環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250013;3.山東省環(huán)境保護(hù)廳，山東 濟(jì)南 250012)

0 引言

隨著城市化、工業(yè)化進(jìn)程加快，以及長(zhǎng)期以來(lái)的粗放型經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)模式，嚴(yán)重破壞了水體環(huán)境及功能[1－2]。水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的“水華”號(hào)稱水體“癌癥”，長(zhǎng)期困擾水環(huán)境工作者，其中銅綠微囊藻是形成“水華”的主要種類之一，由于其產(chǎn)生藻毒素，嚴(yán)重影響水體生態(tài)功能。傳統(tǒng)物、化法控制水華，雖然高效迅速，但會(huì)破壞生態(tài)平衡并造成二次污染，因此尋求一種高效安全的抑藻方法具有重要意義。植物化感作用抑藻作為一種新型安全的生物抑藻技術(shù)備受青睞[3－4]。許多研究表明，水生、陸生植物以及某些大型藻類均具有抑制藻類生長(zhǎng)的作用[5－8]。

仙人掌屬植物(Opuntia SPP)栽培簡(jiǎn)單，無(wú)病蟲害，在我國(guó)分布極為廣泛。我國(guó)清代趙學(xué)敏所著的《本草綱目拾遺》記載仙人掌具有清熱解毒、消腫止痛的藥用價(jià)值;現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)仙人掌具有較強(qiáng)的抑菌消炎等多種藥理作用。翁佩芳研究發(fā)現(xiàn)鮮仙人掌汁液抑菌作用明顯，且對(duì)革蘭氏陰性菌抑制作用強(qiáng)于陽(yáng)性菌[9]。M.A.Alamsjah等人進(jìn)一步證實(shí)抑菌物質(zhì)可能是皂苷、生物堿、酚類、有機(jī)酸類等物質(zhì)，仙人掌的抑菌機(jī)理可能是上述一種或幾種物質(zhì)水解了細(xì)菌細(xì)胞壁中的糖苷鍵，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞出現(xiàn)部分缺失，形成缺壁細(xì)胞，細(xì)胞壁失去了對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物的保護(hù)作用，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)解體出現(xiàn)空腔;也可能是仙人掌提取物滲透入細(xì)胞內(nèi)，吸附胞內(nèi)帶有陰離子的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，并發(fā)生絮凝作用，擾亂細(xì)胞正常的生理活動(dòng)，從而殺滅細(xì)菌[10]。銅綠微囊藻屬于原核生物其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陰性菌相似，而仙人掌又具有環(huán)境友好型、經(jīng)濟(jì)型抑藻劑潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值，且仙人掌浸提液的抑藻實(shí)驗(yàn)研究，在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。因此本文以銅綠微囊藻為研究對(duì)象，研究鮮仙人掌莖水浸提液及乙醇浸提液的抑藻效果，為開(kāi)發(fā)高效、無(wú)毒、天然的除藻劑治理富營(yíng)養(yǎng)化水體提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)植物水培技術(shù)的成熟與人工浮島的廣泛應(yīng)用，為仙人掌屬植物應(yīng)用于富營(yíng)養(yǎng)水體修復(fù)提供了可靠基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)藻種購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種庫(kù)(FACHB-940)，是產(chǎn)毒藻株。仙人掌購(gòu)自濟(jì)南解放橋花卉市場(chǎng)。

1.2 銅綠微囊藻培養(yǎng)基成分

銅綠微囊藻培養(yǎng)基采用BG11培養(yǎng)基，其配方見(jiàn)表1。

表1 BG11培養(yǎng)基配方 mg/L

1.3 仙人掌浸提液的制備

鮮仙人掌莖水提取液:去刺、洗凈、搗碎，與一定量的水混合，常溫浸提3h，抽濾(重復(fù)3次)，合并濾液后于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮(水浴恒溫58℃，水真空)，制成1g/mL的仙人掌水浸提液(即1mL浸提液含有鮮仙人掌的提取物1g)。

鮮仙人掌莖乙醇提取液:去刺、洗凈、搗碎，按料液比1∶30(g/mL)加入72%(Ⅴ/Ⅴ)乙醇溶液，浸提3h，抽濾(重復(fù)3次)，合并濾液減壓蒸餾，揮去乙醇，并在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮(水浴恒溫58℃，水真空)，制成1g/mL的仙人掌乙醇浸提液。

以上兩種提取方法得到的仙人掌浸提液又經(jīng)過(guò)A、B兩種處理。A處理:分別過(guò)細(xì)菌濾器除菌，并經(jīng)紫外滅菌15min;B處理:高壓蒸汽滅菌(121℃，20min)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將上述兩種溶劑浸提的A、B兩種處理的鮮仙人掌溶液分別加入裝有100mL BG11培養(yǎng)基的250mL 錐形瓶，配成含有鮮仙人掌 0、20、40、60、80mg/mL的濃度梯度，每組3個(gè)平行。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液接種于上述濃度梯度的培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光強(qiáng)2150lux，光暗比12h∶12h，光照期間溫度為29±1℃，無(wú)光照期間溫度為23±1℃，每天8:00，12:00，16:00，20:00 定時(shí)搖瓶2min，轉(zhuǎn)速30rmp，共培養(yǎng) 7d。

1.5 細(xì)胞數(shù)及葉綠素a的測(cè)定和葉綠素a的抑制率計(jì)算

每24h用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下(10×40倍)計(jì)數(shù)藻數(shù)。實(shí)驗(yàn)第7天測(cè)定了B處理組的不同濃度組葉綠素a的含量，取樣體積為50mL，在抽氣負(fù)壓小于50kPa的條件下，經(jīng)玻璃纖維濾膜過(guò)濾。過(guò)濾后的濾膜1h內(nèi)放入15mL具塞試管中，加入10mL體積分?jǐn)?shù)為90%的丙酮，蓋緊試管塞，振蕩后鋁箔包裹立即放入冰箱，萃取20h。測(cè)定時(shí)取出樣品30min，使樣品溫度與室溫一致后，熒光分光光度法測(cè)定葉綠素a含量，按下式計(jì)算各組葉綠素a的抑制率，用來(lái)表征不同方式不同濃度的浸提液對(duì)藻類的抑制效應(yīng)。

抑制率(%)=(對(duì)照組吸光光度變化值－樣品的吸光光度變化值)/對(duì)照組吸光光度變化值 ×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鮮仙人掌水浸提液脅迫下銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)量的變化

圖1 鮮仙人掌水浸液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

從圖1可以看出隨著鮮仙人掌水浸提液濃度的升高，銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)量持續(xù)下降。只有20mg/mL組在實(shí)驗(yàn)前5天藻細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組，因?yàn)橄扇苏魄o含有蛋白質(zhì)、維生素、有機(jī)酸、樹(shù)脂、礦物質(zhì)及豐富的黃酮類物質(zhì)，可能是少量的仙人掌提取液刺激了銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。因?yàn)楸M管銅綠微囊藻是光合自養(yǎng)菌，但曾有報(bào)道在微量有機(jī)碳源存在下其生長(zhǎng)會(huì)更好[11]。除100mg/mL實(shí)驗(yàn)組外，各組均隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞持續(xù)增加。100mg/mL實(shí)驗(yàn)組第4天鏡檢就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞已經(jīng)嚴(yán)重退綠黃化，第5天藻已全部死亡降解，鏡檢不到完整細(xì)胞。

圖1顯示，A、B處理組對(duì)藻的抑制效果無(wú)明顯差異，說(shuō)明仙人掌有效抑藻成分比較穩(wěn)定不會(huì)受高溫破壞。

2.2 不同濃度鮮仙人掌乙醇浸提液脅迫下銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)量的變化

圖2 鮮仙人掌乙醇提取液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

圖2顯示隨著鮮仙人掌乙醇提取液濃度的增加，藻細(xì)胞數(shù)量持續(xù)下降。80mg/mL、100mg/mL實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞持續(xù)下降，80mg/mL組實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)鏡檢未見(jiàn)到完整細(xì)胞，完全分解;100mg/mL實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)第3天細(xì)胞即全部死亡分解。說(shuō)明鮮仙人掌乙醇提取液比水提取液中抑藻成分活性高。A、B處理組對(duì)藻的抑制效果無(wú)明顯差異，乙醇提取液中抑藻成分未受高溫、紫外破壞。

2.3 不同濃度鮮仙人掌浸提液脅迫下銅綠微囊藻葉綠素a含量的變化

圖3、圖4分別顯示鮮仙人掌水、乙醇提取液對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a含量及葉綠素a抑制率的影響，從圖中可以看出鮮仙人掌乙醇提取液比水提取液活性高。

圖3 鮮仙人掌水提取液及乙醇提取液B處理組對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

圖4 鮮仙人掌水提取液及乙醇提取液B處理組對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a抑制率比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鮮仙人掌水浸提液及乙醇浸提液均能有效抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，且強(qiáng)度隨浸提液濃度的增大而明顯增強(qiáng)。鮮仙人掌的72%乙醇浸提液的抑藻效果大于水浸提液，可能是乙醇對(duì)仙人掌的有效抑藻成分提取更加完全的緣故，但具體是仙人掌汁液中哪種化學(xué)物質(zhì)起到抑藻作用及是否是多種成分聯(lián)合抑藻還需進(jìn)一步研究。選用乙醇作為仙人掌的提取溶劑可提高抑藻劑的有效性，結(jié)合其抑藻效率及考慮抑藻成本在大劑量及預(yù)防水華爆發(fā)時(shí)使用可選擇水浸提液。若仙人掌根中有效抑藻成分高且其為胞外分泌物則可選擇浮床水培直接抑藻，不僅可以化感抑藻而且通過(guò)定期收割仙人掌還可除去水體氮磷等營(yíng)養(yǎng)鹽減輕水體富營(yíng)養(yǎng)化。開(kāi)發(fā)抑藻劑需要抑藻成分達(dá)到一定的濃度，除乙醇外其他有機(jī)溶劑是否對(duì)鮮仙人掌抑藻成分有更高的提取效率有待于進(jìn)一步研究;篩選高效植株、品種及考察一年生及多年生植株的抑藻活力的差異也是必要的。

化感抑藻物質(zhì)可以通過(guò)多種途徑抑制藻類生長(zhǎng)，前人研究仙人掌殺菌機(jī)理可能是通過(guò)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)兩種提取液均抑制了銅綠微囊藻葉綠素a的含量，因此鮮仙人掌化感抑藻機(jī)理是上述哪種方式及是否是多種方式協(xié)同作用有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

(1)鮮仙人掌莖的水浸提液和乙醇浸提液對(duì)銅綠微囊藻均有明顯的抑制作用，且有較好的量效關(guān)系，乙醇浸提液抑制效果強(qiáng)于水浸提液。

(2)鮮仙人掌莖浸提液抑藻成分穩(wěn)定，經(jīng)紫外高壓蒸汽滅菌后仍具有較強(qiáng)抑藻效果。

(3)鮮仙人掌有應(yīng)用于水體富營(yíng)養(yǎng)化治理和開(kāi)發(fā)新型抑藻劑的潛力。

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