鐘傳青，黃為一

(1.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟南 250101;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

0 引言

凡促使磷酸中的酯和酐水解的一大類酶，統(tǒng)稱為磷酸酶，磷酸酶是土壤中最活躍的酶類，其酶促反應(yīng)能夠加速有機磷的脫磷速度[1]。磷酸酶是表征土壤生物學(xué)活性的重要酶之一[2]，其活性可作為衡量土壤肥力的指標;產(chǎn)生酸性磷酸酶的生物有微生物、原生動物和植物等;產(chǎn)生堿性磷酸酶的生物有微生物、藻類、蚯蚓等[3]。編碼磷酸酶的基因已經(jīng)被克隆出來[4]，張國慶等分離純化了一株內(nèi)生真菌中的酸性磷酸酶[5]。

磷是促進植物生長的重要元素之一[6]，無論是酸性磷酸酶還是堿性磷酸酶，均與土壤有效磷有很強相關(guān)性[7]。P17菌株為作者從南京市化工磷肥廠區(qū)磷礦粉與土的混合物中分離出的一株解磷微生物，經(jīng)鑒定屬于巨大芽孢桿菌屬，該菌株能夠分泌高活性的磷酸酶[8]，將土壤中難溶性有機磷轉(zhuǎn)化為有效磷，從而可以直接被植物生長利用。作為一種酶類，磷酸酶的活性受多種因素影響，為保證解磷微生物P17菌株施入土壤后發(fā)揮高的解磷活性，本課題組研究了P17菌株發(fā)酵過程中影響磷酸酶活性的因素，并確定該酶的定域，為巨大芽孢桿菌磷酸酶制劑的制備及下游生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器:搖床，顯微鏡，分光光度計，離心機等。

菌株:P17菌株。

培養(yǎng)基:NBRIP培養(yǎng)基。其成分為:Ca3(PO4)25.0g，(NH4)2SO40.1g，MgSO4·7H2O 0.25g，KCl 0.2 g，葡萄糖10.0g，MgCl2·7H2O 5.0g，蒸餾水 1000mL，pH6.8 ～7.0。

1.2 試劑

磷酸酶活性測定:改進的MUB緩沖液;0.025M對硝基苯磷酸二鈉溶液;0.5M氯化鈣;0.5M氫氧化鈉;標準對硝基酚溶液。

磷酸酶定域研究:10mmol/L Tris·Cl(pH8.0);10mmol/L Tris·Cl(pH7.5);25%蔗糖。

發(fā)酵液蛋白含量測定所需試劑:0.15mol/L NaCl溶液;標準溶液;考馬斯亮藍試劑。

1.3 方法

(1)不同碳、氮源對P17菌株產(chǎn)生磷酸酶活性的影響

分別用等量碳源，如蔗糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、糊精、木糖、山梨糖、淀粉等替代NBRIP培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖;或者用等量氮源如氯化銨、磷酸氫二銨、硝酸銨、硝酸鈉、黃豆粉、胰蛋白胨、蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母膏等替代NBRIP培養(yǎng)基中的硫酸銨，其它成分和含量保持不變。

表中：ρ為土體密度，ω為天然含水率，ωp為土體塑限，ωL為土體液限，c為粘聚力，φ為內(nèi)摩擦角，k為土體的滲透系數(shù)。

配制含不同碳源、氮源的培養(yǎng)基，每種碳源、氮源各設(shè)三個重復(fù)，分裝50mL于250mL三角瓶中，滅菌。按5%接種量接種在含不同碳源、氮源培養(yǎng)基內(nèi)，48h后檢測發(fā)酵液pH值、吸光值(550nm)、上清酸性和堿性磷酸酶活性。

(2)磷酸鹽種類與P17菌株生長以及磷酸酶活性的關(guān)系

分別用等量磷酸鹽替代NBRIP培養(yǎng)基中的磷酸鈣，接種后檢測磷酸鹽種類對P17菌株的生長、發(fā)酵液pH值以及酸性、堿性磷酸酶活性的影響。

(3)磷酸酶活性測定

按照佩奇等提供方法檢測發(fā)酵液中磷酸酶活性[9]。

(4)發(fā)酵液pH值測定

(5)發(fā)酵液生物量測定

打開分光光度計，將波長調(diào)在550nm，預(yù)熱半小時后測量發(fā)酵液的吸光值。

(6)磷酸酶定域研究

取發(fā)酵24h菌液，按照戴樹桂等方法測定酶域所在[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源與P17菌株生長及其磷酸酶活性的關(guān)系

由表1可知，P17菌株在以葡萄糖為碳源時酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性最高，菌體生長量最大，利于代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生;而以麥芽糖、糊精和可溶性淀粉等復(fù)合碳源為碳源時P17菌株產(chǎn)生的磷酸酶活性較低;以甘露醇和可溶性淀粉為碳源時產(chǎn)生的堿性磷酸酶活性較低。

表1 碳源種類對P17菌株生長以及產(chǎn)生磷酸酶活性的影響

2.2 不同氮源與P17菌株生長磷酸酶活性的關(guān)系

表2 氮源種類對P17菌株生長以及產(chǎn)生磷酸酶活性的影響

表2中數(shù)據(jù)表明，巨大芽胞桿菌P17菌株在以黃豆粉、胰蛋白胨復(fù)合氮源等為氮源時能夠產(chǎn)生較高活性的酸性磷酸酶;以胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏等為氮源時也能產(chǎn)生很高活性的堿性磷酸酶?？赡苁菑?fù)合氮源內(nèi)含有能夠提高磷酸酶活性的微量元素或者金屬離子。

2.3 磷酸鹽種類與P17菌株生長以及磷酸酶活性的關(guān)系

由圖1可以看出，發(fā)酵過程中，以各種磷酸鹽為磷源時巨大芽孢桿菌P17菌株產(chǎn)生的酸性磷酸酶活性除以黃麥嶺磷礦粉為磷源外普遍高于堿性磷酸酶活性。以植酸鈣為磷源時酸性磷酸酶活性最高，說明有機磷源較少時會誘導(dǎo)酸性磷酸酶的產(chǎn)生;而培養(yǎng)基中沒有有機磷源、只有難溶無機磷源時酸性磷酸酶仍有活性，說明培養(yǎng)基中存在其它底物如微生物菌體細胞膜的磷脂、核酸等，也可能與菌體生長量有關(guān)，以植酸鈣為磷源時巨大芽孢桿菌P17菌株長勢最好，從而促進了酸性磷酸酶的分泌。而堿性磷酸酶在培養(yǎng)基中沒有磷源時活性最高，其次為黃麥嶺磷礦粉，以NH4H2PO4為磷源時該方法不能檢測堿性磷酸酶活性。

圖1 巨大芽孢桿菌P17菌株以不同含磷物質(zhì)為磷源時磷酸酶活性比較

2.4 磷酸酶定域研究

表3 P17菌株產(chǎn)生磷酸酶定域的研究結(jié)果

由表3可以看出，巨大芽孢桿菌P17菌株發(fā)酵至16h甚至48h后，各成分酶活性大小順序為:磷酸酶胞外提取液S1+S2+S3＞膜內(nèi)提取液S5＞膜周質(zhì)提取液S4。說明酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均為胞外酶，在發(fā)酵過程中大部分被分泌到胞外。

3 研究結(jié)論

前期研究表明P17菌株能夠有效溶解植酸鈣、卵磷脂等[8]，并且能夠分泌大量的有機酸和無機酸[11]，將土壤、磷礦粉中的難溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)橛行Я?，以利于植物吸收。本研究結(jié)果表明P17菌株能夠產(chǎn)生高活性的磷酸酶，且不同的碳源、氮源及磷酸鹽對于該菌株磷酸酶的活性有著較大的影響，相同的碳源、氮源及磷酸鹽對該菌株酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的影響結(jié)果不同。該菌株以葡萄糖為碳源、黃豆粉等復(fù)合氮源、植酸鈣為磷源時酸性磷酸酶活性最高，且該菌株分泌的酸性和堿性磷酸酶均為胞外酶。磷酸酶可以直接將難溶的有機磷轉(zhuǎn)化為植物可以直接吸收利用的無機磷，該菌株能夠分泌磷酸酶解釋了巨大芽孢桿菌的作用機制。從研究結(jié)果來看，因磷酸酶為胞外酶，表明其發(fā)酵液可以直接用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn);同時該研究也為深入探討解磷微生物促進植物生長的作用機制、生物磷肥和磷酸酶制劑的研究與開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

[1]劉淑英.有機無機肥配施對灌耕灰鈣土堿性磷酸酶和土壤磷素的影響[J].土壤通報，2011，42(3):670－675.

[2]才曉玲，李志洪，何偉，等.土壤質(zhì)量密度對玉米根系N、P、K含量及土壤磷酸酶的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，46(3):38－42.

[3]AHMAD A K，GHULAM J，MOHAMMAD S A，et al.Phosphorus solubilizing bacteria:occurrence，mechanisms and their role in crop production[J].J Agric Biol Sci，2009，1(1):48 － 58.

[4]趙洪新，來奇恒，楊程，等.產(chǎn)氣腸桿菌磷酸酶基因克隆表達及其特性[J].化工學(xué)報，2008，59(8):2071－2078.

[5]張國慶，王有志，王守現(xiàn)，等.樹狀多節(jié)孢酸性磷酸酶的分離純化與性質(zhì)研究[J].菌物學(xué)報，2011，30(5):753 －759.

[6]LIU Jun-jie，WANG Guang-hua，JIN Jian，et al.Effects of different concentrations of phosphorus on microbial communities in soybean rhizosphere grown in two types of soils[J].Ann Microbiol，2011，61(3):525 －534.

[7]耿玉清，白翠霞，趙廣亮，等.土壤磷酸酶活性及其與有機磷組分的相關(guān)性[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，30(2):139 －143.

[8]鐘傳青，黃為一.不同種類解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的變化[J].土壤學(xué)報，2005，42(2):286 －294.

[9]佩奇A L，米勒R H.土壤分析法[M].閔九康，郝心仁，嚴慧峻，等譯.北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1991:592－599.

[10]戴樹桂，莊源益，陳勇生，等.兩種假單胞菌中二氯酚降解酶及其定域研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，1996，16(2):173 －178.

[11]鐘傳青，黃為一.磷細菌P17對不同來源磷礦粉的溶磷作用及機制[J].土壤學(xué)報，2004，41(6):931－937.