辛杭書(shū) 段春宇 張永根 王明君 李仲玉 王志博 李富國(guó)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030)

甲烷是反芻動(dòng)物瘤胃正常消化的產(chǎn)物，瘤胃內(nèi)排放的甲烷量占甲烷排放總量的15%～25%，而且反芻動(dòng)物甲烷排放損失的能量占到飼料攝入能量的2% ～12%［1］。因此，抑制瘤胃甲烷的產(chǎn)生對(duì)提高飼料能量利用率和減輕溫室效應(yīng)具有重要的意義。海南霉素是近年中科院藥物研究所研制的國(guó)內(nèi)第1個(gè)羧基型聚醚類(lèi)離子載體，它與瘤胃素、鹽霉素結(jié)構(gòu)相似，與莫能菌素有許多共同之處，是一種新型的反芻動(dòng)物飼料添加劑［2］。它可以有效地降低反芻動(dòng)物甲烷的排放量［3－4］，并具有保護(hù)瘤胃肽和可溶性蛋白質(zhì)的作用［5－6］，能改變山羊瘤胃發(fā)酵類(lèi)型，明顯提高丙酸比例，抑制飼料蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解;在體外發(fā)酵試驗(yàn)中，能有效地減緩瘤胃液pH下降、減少產(chǎn)氣量、減少氨態(tài)氮的含量、降低乙酸和丙酸比［7］，并且改變了瘤胃微生物區(qū)系。但體外試驗(yàn)有很多局限性，如果在動(dòng)物飼糧中添加海南霉素是否同樣會(huì)通過(guò)改變微生物區(qū)系來(lái)調(diào)控甲烷產(chǎn)量?調(diào)控機(jī)理是否相同呢?基于此，設(shè)計(jì)了本試驗(yàn)，旨在研究奶牛飼糧中添加海南霉素對(duì)其瘤胃微生物區(qū)系的影響，為海南霉素調(diào)控甲烷產(chǎn)生的機(jī)理性研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧組成

選用3頭體況良好，體重相近(460.0±20.6)kg，安裝有永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛。基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，精粗比為50∶50。海南霉素和莫能菌素分別由山東勝利股份有限公司和美國(guó)禮來(lái)公司贈(zèng)送，純度均≥90%，飼喂前混合于精料中飼喂。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用3×3拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)對(duì)照組:負(fù)對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧;正對(duì)照組在基礎(chǔ)飼糧添加中350 mg/d莫能菌素。海南霉素組在基礎(chǔ)飼糧中添加20 mg/d海南霉素。預(yù)試期10d，正試期5d，共15d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basaldiet(DM basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)牛拴系飼養(yǎng)，每日飼喂2次(08:00和20:00)，先粗后精，自由飲水。

1.4 樣品采集

每階段正試期的第4、5天晨飼前(0 h)、晨飼后2、4、6、8和10 h于瘤胃腹囊處采集瘤胃液，用無(wú)菌的2層紗布過(guò)濾，用滅菌離心管取瘤胃液迅速放入液氮罐，帶回實(shí)驗(yàn)室后于－80℃保存。用于基因組DNA的提取。

1.5 樣品分析

1.5.1 瘤胃微生物總DNA的提取方法

采用珠磨－十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取總DNA，提取后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定提取的總DNA濃度和純度，取符合樣品的OD260nm與 OD280nm比值應(yīng)在 1.6 ～1.8 之間(平均在1.75左右)，且用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的DNA在加樣孔附近呈現(xiàn)一致密亮帶的樣品待測(cè)，－20℃保存。

1.5.2 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)條件及引物的設(shè)計(jì)與合成

從瘤胃微生物總DNA中擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA。

反轉(zhuǎn)錄 PCR反應(yīng)體系:10×緩沖液2 μL，10 mmol/L的dNTP 0.4 μL，10 μmol/L 的引物各0.8 μL，25 mmol/L 的氯化鎂(MgCl2)1.6 μL，模板總 DNA 0.4 μL，TaqDNA 聚合酶 2 μL，雙蒸水為 13.6 μL，總體積為 20 μL。

反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)參數(shù):95℃變性7 min;95℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。

瘤胃微生物的16S rDNA全序列引物見(jiàn)表2［8］，本試驗(yàn)用到的所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.5.3 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)的反應(yīng)條件及引物的設(shè)計(jì)與合成

qRT-PCR的反應(yīng)條件參照SYBR Premix Ex TaqTM 試劑建立25 μL反應(yīng)體系及反應(yīng)條件［3］。qRT-PCR的引物參照文獻(xiàn)［9－11］報(bào)道的瘤胃總細(xì)菌、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、真菌(fungi)、甲烷菌(Ruminococcus methanogen)和原蟲(chóng)(protozoa)引物序列(表3)。

表2 瘤胃微生物的16S rDNA全序列引物Table 2 Primers of whole length 16S rDNA of rumen microorganisms

表3 qRT-PCR引物序列Table 3 Sequences of primers for qRT-PCR assay

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)測(cè)得的閾值循環(huán)(Ct)和以下公式［3］將目標(biāo)菌含量表示為相對(duì)于瘤胃總細(xì)菌16S rDNA的百分比:

目標(biāo)菌含量(%)=100 ×［2－(目標(biāo)菌Ct－總細(xì)菌Ct)］。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel初步記錄并做簡(jiǎn)單處理，利用7500 System Software分析qRT-PCR結(jié)果。然后采用SAS 9.1軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并用混合模型(mixed procedure)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 瘤胃微生物DNA的反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果

利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖1。從產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、甲烷菌、原蟲(chóng)和真菌的基因擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果可以看出，每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符，并且擴(kuò)增所得的目的片段均呈1條的亮帶，無(wú)雜帶和拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物及提取的基因組DNA均可用于qRT-PCR。

2.2 瘤胃微生物的qRT-PCR結(jié)果

運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)，對(duì)瘤胃產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、甲烷菌、原蟲(chóng)和真菌含量的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。由表4可見(jiàn)，奶牛飼糧中添加海南霉素，極顯著降低了溶纖維丁酸弧菌、原蟲(chóng)和真菌的含量(P＜0.01)，并且海南霉素對(duì)瘤胃微生物的抑制作用與莫能菌素正對(duì)照組相似。與負(fù)對(duì)照組相比，海南霉素將溶纖維丁酸弧菌、原蟲(chóng)和真菌的含量分別減少了 38.24%、60.24% 和 12.73%，差異極顯著(P＜0.01)。而海南霉素和莫能菌素對(duì)瘤胃黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌和甲烷菌的含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

由圖2可見(jiàn)，海南霉素和莫能菌素對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的瘤胃溶纖維丁酸弧菌、原蟲(chóng)和真菌均有明顯的抑制作用，并且各組每種菌的含量均隨著時(shí)間的變化而發(fā)生變化，雖然變化規(guī)律并不是很一致，但均呈現(xiàn)一定的持續(xù)性。其中，海南霉素組和負(fù)對(duì)照組的溶纖維丁酸弧菌隨著時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先下降后升高再下降的趨勢(shì)，而正對(duì)照組則呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢(shì);負(fù)對(duì)照組的原蟲(chóng)變化沒(méi)有明顯的規(guī)律，其他2組則隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì);真菌的變化規(guī)律比較一致，3組均為先升高后緩慢下降的趨勢(shì);各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌的生長(zhǎng)繁殖并沒(méi)有被海南霉素和莫能菌素明顯抑制，它們的含量也隨時(shí)間變化而變化，但變化仍無(wú)明顯的規(guī)律，其中，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而先升高后下降，白色瘤胃球菌隨著時(shí)間的變化而呈現(xiàn)先下降后升高再緩慢下降的趨勢(shì)，對(duì)于黃色瘤胃球菌，3組的變化均無(wú)明顯的規(guī)律;海南霉素組和正對(duì)照組的甲烷菌含量與負(fù)對(duì)照組相似，均不受時(shí)間影響，且每組甲烷菌的含量始終穩(wěn)定在0.46% ～0.48%。

圖1 瘤胃細(xì)菌、真菌和原蟲(chóng)DNA反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果Fig.1 Reverse transcription PCR results of DNA of bacteria，fungi and protozoa in the rumen

表4 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響Table 4 Effects ofdietary hainanmycin on rumen microflora ofdairy cows %

圖2 飼糧中添加海南霉素對(duì)奶牛瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)、真菌含量的影響Fig.2 Effects ofdietary hainanmycin on contents of bacteria，fungi and protozoa in the rumen ofdairy cows

3 討論

瘤胃中的纖維降解細(xì)菌主要有黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌。據(jù)報(bào)道，莫能菌素和其他離子載體主要選擇性抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，它們會(huì)在某些革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞膜積累，催促離子快速向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致無(wú)益的離子流，同時(shí)菌體ATP酶活性升高，產(chǎn)生大量的ATP來(lái)抵制無(wú)益的離子流動(dòng)，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量耗盡，進(jìn)而抑制菌體的生長(zhǎng)繁殖［12－13］。但革蘭氏陰性菌不會(huì)被抑制，因?yàn)樗募?xì)胞膜外有一層脂多糖層，會(huì)抑制離子載體對(duì)細(xì)胞膜的入侵［14］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，奶牛飼糧中添加海南霉素后，瘤胃溶纖維丁酸弧菌的含量顯著降低，而黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的含量無(wú)顯著變化。溶纖維丁酸弧菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，飼糧中添加海南霉素后，它的生長(zhǎng)被抑制，而產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是革蘭氏陰性菌，它的生長(zhǎng)并沒(méi)有被明顯抑制。然而，黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌雖然都是革蘭氏陽(yáng)性菌，但這2種細(xì)菌的細(xì)胞膜外也有類(lèi)似于革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖層，會(huì)抑制離子載體進(jìn)入細(xì)胞膜，所以離子載體并不能有效抑制它們的生長(zhǎng)［15－16］。

氫氣是瘤胃中甲烷形成的一種重要底物，有研究表明，離子載體能抑制產(chǎn)氫菌的生長(zhǎng)，從而抑制了甲烷生成的重要底物——?dú)錃獾姆e累，阻礙了合成甲烷的主要途徑，最終抑制了甲烷的生成。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加海南霉素和莫能菌素后瘤胃溶纖維丁酸弧菌含量顯著降低，劉薇等［3］模擬瘤胃內(nèi)環(huán)境在體外培養(yǎng)條件下研究海南霉素對(duì)瘤胃微生物影響的結(jié)果也表明，海南霉素抑制了溶纖維丁酸弧菌的生長(zhǎng)繁殖，溶纖維丁酸弧菌的發(fā)酵產(chǎn)物主要由二氧化碳、氫氣、乙醇、乙酸、丁酸、甲酸和乳酸。因此，當(dāng)它的數(shù)量顯著降低后，產(chǎn)生的氫氣也會(huì)降低，所以其數(shù)量的降低導(dǎo)致瘤胃內(nèi)氫氣的生成減少，這也是瘤胃甲烷生成量降低的一個(gè)原因(甲烷產(chǎn)生量的數(shù)據(jù)見(jiàn)本課題組之前的研究報(bào)道［4］)。另外還有研究也表明，在飼糧中添加莫能菌素后，奶牛瘤胃溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量顯著降低［17］。

瘤胃中除大量的產(chǎn)氫氣細(xì)菌外，也存在大量產(chǎn)生氫氣的真菌，真菌在瘤胃發(fā)酵中產(chǎn)生乳酸、甲酸和乙醇等發(fā)酵產(chǎn)物，其中，大部分的產(chǎn)物都能被甲烷菌利用生成甲烷。同時(shí)在電子傳遞過(guò)程中產(chǎn)生氫氣，這些真菌與甲烷菌之間存在著種間氫轉(zhuǎn)移，它們產(chǎn)生的氫氣會(huì)被甲烷菌利用合成甲烷，當(dāng)真菌的生長(zhǎng)受到抑制時(shí)，產(chǎn)物也會(huì)相應(yīng)減少，而用于合成甲烷的底物的量就會(huì)減少，因此，甲烷的生成并將受到抑制。本試驗(yàn)結(jié)果表明，莫能菌素都顯著抑制了瘤胃真菌的生長(zhǎng)，這與Cann等［18］的研究結(jié)果一致，并且，Stewart等［19］研究也表明，莫能菌素能抑制無(wú)菌的半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的真菌的生長(zhǎng)，降低氫氣的生成。本試驗(yàn)得出，海南霉素與莫能菌素的作用效果相似。

奶牛飼糧中添加莫能菌素顯著降低了瘤胃原蟲(chóng)的數(shù)量，Nagaraja等［20］模擬瘤胃進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，莫能菌素導(dǎo)致原蟲(chóng)數(shù)量大幅減少。由于甲烷菌和原蟲(chóng)有內(nèi)外共生的特性，故原蟲(chóng)對(duì)于甲烷的生成亦有很大貢獻(xiàn)，離子載體抑制瘤胃甲烷的生成可能與原蟲(chóng)數(shù)量下降有關(guān)，瘤胃原蟲(chóng)表面附著瘤胃產(chǎn)甲烷菌，與原蟲(chóng)形成共生體［21］。瘤胃原蟲(chóng)的細(xì)胞膜內(nèi)壁結(jié)合有多種脫氫酶催化各自的底物脫氫，產(chǎn)生的氫分子附著在原蟲(chóng)上，而附著在原蟲(chóng)上的產(chǎn)甲烷菌則能夠通過(guò)種間氫轉(zhuǎn)移利用這些氫分子合成甲烷［22］。當(dāng)原蟲(chóng)的數(shù)量降低時(shí)，產(chǎn)甲烷菌的可附著物減少，可利用的氫源減少，甲烷的生成量降低，并且減少了瘤胃發(fā)酵損失的能量。當(dāng)飼糧中添加海南霉素時(shí)，瘤胃原蟲(chóng)數(shù)量也顯著降低了，由此可見(jiàn)，海南霉素可能也存在與莫能菌素類(lèi)似的影響機(jī)制。

Van Nevel等［23］研究表明，莫能菌素抑制瘤胃甲烷生成并不是對(duì)甲烷菌有特殊的毒害作用，而是抑制甲酸生成氫的反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，莫能菌素對(duì)甲烷菌的生長(zhǎng)繁殖幾乎沒(méi)有影響，這與Weimer等［24］的試驗(yàn)結(jié)論相吻合，飼糧中添加莫能菌素后，產(chǎn)甲烷菌能適應(yīng)飼糧添加莫能菌素的瘤胃環(huán)境，維持它們的數(shù)量。Hook等［25］通過(guò)6個(gè)月的試驗(yàn)，采用qRT-PCR方法研究了莫能菌素對(duì)瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的影響，結(jié)果表明，莫能菌素沒(méi)有顯著影響瘤胃產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量。飼糧中添加海南霉素后，瘤胃甲烷菌的數(shù)量也沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明海南霉素與莫能菌素相似，都沒(méi)有影響瘤胃甲烷菌的數(shù)量。由此可見(jiàn)，海南霉素和莫能菌素降低瘤胃甲烷的生成量并不是直接作用于瘤胃甲烷菌，而是作用于和甲烷生成相關(guān)菌或改變瘤胃發(fā)酵類(lèi)型等方式來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論

飼糧中添加海南霉素改變了瘤胃微生物區(qū)系，海南霉素對(duì)瘤胃產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和甲烷菌含量無(wú)顯著影響，但顯著降低了溶纖維丁酸弧菌、原蟲(chóng)和真菌含量。

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