王艷飛,王紅英,曹雪濱△,任 越,張 剛,何建成,胡元會

(1.解放軍二五二醫(yī)院,河北 保定 071000;2.保定市第五醫(yī)院,河北保定 071001;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,上海 201203;4.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053)

細胞凋亡(apoptosis)是細胞死亡的一種重要形式,即程序性細胞死亡。自1972年Kerr等首次提出細胞凋亡以來,凋亡一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點。凋亡使工作心肌細胞絕對數(shù)量減少,而導(dǎo)致心肌收縮力下降。越來越多的研究結(jié)果表明細胞凋亡與慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1,2]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-conveting enzyme inhibitor,ACEI)主要針對神經(jīng)-體液反應(yīng),可改善癥狀,降低死亡率。本實驗通過建立壓力超負荷心衰大鼠模型,經(jīng)ACEI類藥物卡托普利治療后,觀察其對心衰大鼠心肌細胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達的影響,進一步研究卡托普利治療慢性壓力超負荷心衰的可能機理。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與實驗藥品

流式細胞儀(EPICS-XLⅡ,美國Beckman Coulter公司);Bax單克隆抗體(克隆號B-9,編號I1004);Bcl-2單克隆抗體(克隆號C-2,編號G3106);均為美國Santa-Cruz公司產(chǎn)品。卡托普利:25 mg/tablet,批號:國藥準字H32023731(江蘇省常州制藥廠)。

1.2 實驗動物

SD大鼠(清潔級Ⅱ),雄性,體重(200±25)g,90只,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(京)2003-1-003,合格證編號:610119。

1.3 動物模型分組、制備及給藥方法

分組:隨機將90只大鼠分為3組(n=30):假手術(shù)組(SH)、腹主動脈縮窄組(CAA)、卡托普利治療組(CAP)。動物模型制備[3]:10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。經(jīng)左脊肋角區(qū)入路,結(jié)扎腹主動脈縮窄50%～60%。假手術(shù)組:腹主動脈下穿線后打一松結(jié)。給藥方法:SH組及CAA組給予生理鹽水4 ml灌胃,CAP組給予卡托普利 10 mg/(kg·d),加生理鹽水至4ml后灌胃。4周后大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸、心跳加快,紫紺,皮下水腫癥狀,提示模型成功。6周后分別取10只大鼠作為研究對象。10周后,SH組、CAA組、CAP組各死亡10、8、8只,均以剩余大鼠作為研究對象。

1.4 Bax、Bcl-2的檢測

切取心尖部組織0.3 g,放于120目不銹鋼網(wǎng)上,將組織剪碎至1mm3大小,邊揉搓邊以PBS緩沖液沖洗。濾去細胞團塊,收集細胞懸液離心保留沉淀,加入PBS緩沖液0.3 ml,稀釋混勻后分成2份,調(diào)整每份細胞數(shù)為1×106cells/ml,用于檢測心肌細胞Bcl-2、Bax蛋白。分別取單細胞懸液1ml,分別加入0.1 ml工作液濃度的 Bcl-2、Bax單克隆抗體混勻,室溫孵育30 min。加入PBS緩沖液10 ml混勻后離心棄上清。Bcl-2、Bax加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液0.1 ml,室溫孵育30 min避光。加入10 ml PBS緩沖液混勻后離心棄上清。加入PBS緩沖液0.1 ml,經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾后使用流式細胞儀檢測,結(jié)果用平均熒光強度表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠左心室內(nèi)壓上升、下降的最大變化速率比較

CAA組大鼠10周時收縮期左心室內(nèi)壓上升、下降的最大變化速率(±dp/dtmax)較6周時顯著下降(P＜0.01),證實心衰大鼠心功能呈惡化趨勢。CAP組大鼠10周時與6周時比較-dp/dtmax升高(P＜0.05),+dp/dtmax顯著升高(P＜0.01)。提示隨治療時間延長,CAP組大鼠心功能得到進一步改善(表1)。

Tab.1 Comparison of±dp/dtmax in each group between 6week and 10 week(mmHg/s, ±s,n=30)

Tab.1 Comparison of±dp/dtmax in each group between 6week and 10 week(mmHg/s, ±s,n=30)

SH:Sham operation group;CAA:Coarctation of abdominal aorta group;CAP:Captopril intervention group;±dp/dt max:Rate of rise or descend of left ventricular pressure**P＜0.01 vs CAA 6 week group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs CAP 6 week group

Group week +dp/dtmax -dp/dtmax SH 6 3602.28±226.37 3138.74±226.12 10 3779.81±336.77 3146.02±273.37 CAA 6 1145.38±103.39 785.79±74.78 10 844.13±173.20** 671.08±38.40**CAP 6 2142.29±236.94 2019.92±157.42 10 2766.20±204.85## 2247.90±277.56#

2.2 各組大鼠心肌Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

6周及10周時CAA組較SH組Bcl-2蛋白表達顯著下降(P＜0.01),Bax蛋白表達顯著升高(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例顯著下降(P＜0.01)。6周及10周時CAP組較CAA組Bcl-2蛋白表達顯著升高(P＜0.01),Bax蛋白表達顯著降低(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例顯著升高(P＜0.01,表2)。

2.3 10周Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax比例與6周時比較

10周時SH組間心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達均無明顯差異(P＞0.05)。CAA組較 6周時 Bcl-2蛋白表達顯著降低(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例顯著降低(P＜0.01)。CAP組較6周時 Bcl-2蛋白表達明顯升高(P＜0.05),Bax蛋白表達顯著降低(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例顯著升高(P＜0.01,表 2)。

Tab.2 Comparison of Bcl-2、Bax and Bcl-2/Bax in each group between 6 week and 10 week(±s,n=30)

Tab.2 Comparison of Bcl-2、Bax and Bcl-2/Bax in each group between 6 week and 10 week(±s,n=30)

SH:Sham operation group;CAA:Coarctation of abdominal aorta group;CAP:Captopril intervention group**P＜0.01 vs SH group;##P＜0.01 vs CAA group;△△P＜0.01 vs CAA 6 week group;▲P ＜0.05,▲▲P ＜0.01 vs CAP 6 week group

Group week Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax SH 6 460.80±17.87 330.97±20.79 1.40±0.14 10 473.70±21.32 339.29±9.21 1.40±0.05 CAA 6 390.97±20.71** 630.42±9.46** 0.62±0.04**10 348.89±19.63**△△ 659.83±32.81** 0.53±0.05**△△CAP 6 601.16±12.35## 504.22±27.77## 1.20±0.08##10 626.30±20.45##▲ 414.35±31.19##▲▲1.52±0.15##▲▲

3 討論

縮窄腹主動脈導(dǎo)致慢性壓力負荷造成大鼠腎臟缺血,導(dǎo)致腎素生成增加,兒茶酚胺增加,血壓升高?？s窄腹主動脈可直接使血壓升高,心臟后負荷加重,造成左心室肥厚導(dǎo)致左心衰竭。近年來有研究提示心肌細胞凋亡所致的心肌細胞減少是心力衰竭重要的發(fā)病學(xué)機制[4]。ACEI類藥物卡托普利可降低血循環(huán)和心臟組織內(nèi)的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的水平,抑制緩激肽分解、降低金屬蛋白酶活性,抑制心肌纖維化和瘢痕形成,改善梗死心肌高能磷酸鹽代謝。

在細胞凋亡過程中,Bcl-2蛋白抑制細胞凋亡,而Bax蛋白則促進細胞凋亡。Bcl-2與Bax的比例決定細胞是否發(fā)生凋亡。高水平的Bcl-2/Bax有助細胞生存,過低則促進凋亡。本實驗結(jié)果顯示:模型組及治療組大鼠心肌細胞中存在Bcl-2蛋白的表達,在CAA組Bcl-2蛋白表達較低,而Bax蛋白表達最高,Bcl-2/Bax比值最低,證實模型組大鼠心肌細胞凋亡最明顯。在利用卡托普利治療6周、10周后,Bcl-2蛋白表達較CAA組增多,Bax蛋白表達下降,Bcl-2/Bax比值升高,且10周治療效果與6周比較具有統(tǒng)計學(xué)意義,證實卡托普利治療后慢性壓力負荷性心衰大鼠心肌細胞凋亡受到抑制,心功能改善?，F(xiàn)在臨床上應(yīng)用ACEI類及ARB類藥物改善心室重構(gòu)的研究越來越普遍,動物實驗表明,ARB可抑制心肌梗死大鼠的心肌肥厚和纖維化[5]。本實驗結(jié)果進一步提示卡托普利對細胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2的影響,可能為其治療心力衰竭的主要機制之一。

研究結(jié)果提示卡托普利能夠抑制細胞凋亡,為我們在臨床應(yīng)用開辟了新的思路,對其機理的深入研究有助于探討ACEⅠ類藥物治療心力衰竭的機制,進而為其在臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

[1]Sabbah H N,Sharov V G,Goldstein S.Programmed cell death in the progression of heart failure[J].Ann Med,1998,30(Suppl 1):33-38.

[2]Kang PM,Izumo S.Apoptosis and heart failure:a critical review of the literature[J].Circ Res,2000,86(11):1107-1113.

[3]王艷飛,曹雪濱,崔英凱,等.改良大鼠左心室插管術(shù)及心衰大鼠左心功能指標的測定[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(12):34-36.

[4] Els?sser A,Suzuki K,Schaper J.Unresolved issues regarding the role of apoptosis in the pathogenesis of ischemic injury and heart failure[J].J Mol Cell Cardiol,2000,32(5):711-724.

[5]孫 靜,張世殊,毛用敏,等.西拉普利和纈沙坦對大鼠心肌梗死后心肌間質(zhì)成分水平的干預(yù)研究[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2007,19(4):244-245.