白瑞櫻,劉雪琴,王 湜卿,李東亮△

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.濟(jì)源職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系,河南 濟(jì)源 454650)

研究表明,孕酮(progesterone,PROG)不僅可以在神經(jīng)系統(tǒng)中合成和分泌,而且能影響其結(jié)構(gòu)和功能,被稱為“神經(jīng)活性甾體”。本實(shí)驗(yàn)室以往的工作[1]和Ishrat最新的數(shù)據(jù)[2]都表明,PROG在腦缺血損傷中有腦保護(hù)作用,然而PROG腦保護(hù)作用的分子機(jī)制和途徑尚不十分明了。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)作為缺氧調(diào)節(jié)的重要因子,介導(dǎo)機(jī)體對(duì)缺氧缺血產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng),能減輕神經(jīng)損傷[3]。本文以缺氧缺血新生大鼠為研究對(duì)象,研究PR OG預(yù)處理對(duì)腦內(nèi)HIF-1α表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討PROG神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制,試圖為臨床治療缺氧缺血性腦病提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

PROG(sigma公司,批號(hào)0130),實(shí)驗(yàn)前溶于芝麻油配成0.5 mg/ml備用;Trizol(Invitroge公司);Taq酶(上海生物工程公司);HIF-1α多克隆抗體(博士德公司);通用型二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(PV-6001),DAB顯色系統(tǒng)(北京中杉試劑公司)。

1.2 動(dòng)物分組及給藥方法

7日齡SD大鼠80只,雌雄不限,體重 11～16 g(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分成4組(n=10):正常對(duì)照組,假手術(shù)組,缺氧缺血組和孕酮組。正常組不做任何處理,孕酮組動(dòng)物于建立模型前30 min按8 mg/kg腹腔注射PROG液,其余各組注射等容積PROG溶劑芝麻油。

1.3 動(dòng)物模型建立[4]

7日齡大鼠乙醚麻醉后,頸部正中切口,分離和結(jié)扎右頸總動(dòng)脈后縫合切口。然后將動(dòng)物置于37℃低氧箱內(nèi),以1.5 L/min的速度輸入80ml/L氧氣和920 ml/L氮?dú)?持續(xù)2 h,制備缺氧缺血模型。假手術(shù)組在頸部作一切口,僅分離右頸總動(dòng)脈,不結(jié)扎,亦不予缺氧。

1.4 RT-PCR檢測(cè)大鼠皮質(zhì)區(qū) HIF-1α的 mRNA表達(dá)

假手術(shù)組、缺氧缺血組和孕酮組于術(shù)后24 h,正常組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),斷頭取右腦皮質(zhì),用Trizol試劑提取總 RNA(測(cè)定A260/A280＞1.8),以O(shè)ligo為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。所用引物根據(jù)GenBank上所查序列,通過(guò)Primer 5.0程序自行設(shè)計(jì),引物序列為:HIF-1αF-Primer:5′

GGA AAG AAC AAA ACA CGC AG 3′,R-Primer:5′ TTC ACA CACACA ATG CACTG 3′;β-actinF-Primer:5′ ATG GAT GAC GAT ATC GCT GCG 3′,R-Primer:5′ TCG TCC CAG TTG GTG ACA ATG 3′,由上海生物工程公司合成。循環(huán)條件為95℃、5 min;94℃、30 s;60℃、50 s;72℃、30 s,共 30 個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,以Bander leader 3.0凝膠圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析,以目的基因與β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶灰度值之比作為反映目的基因mRNA水平的相對(duì)指標(biāo)。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠皮質(zhì)區(qū)HIF-1α的蛋白表達(dá)

動(dòng)物術(shù)后24 h,在乙醚麻醉下開(kāi)胸,暴露心臟,右心耳開(kāi)洞放血,同時(shí)經(jīng)左心室插灌注針直升至主動(dòng)脈,并滴注生理鹽水沖洗。繼之灌注4%多聚甲醛30 min,斷頭取腦,冠狀切取視交叉后2～4mm腦組織,置于4%多聚甲醛中固定4 h,常規(guī)梯度乙醇脫水、透明、包埋,連續(xù)冠狀切片(厚4～6 μ m)。3%H2O2室溫孵育10 min,微波抗原修復(fù)10 min,室溫冷卻2 h,正常血清封閉30 min,分別滴加一抗(兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體,1∶200),4℃過(guò)夜,加入通用型IgG抗體-HRP多聚體,37℃ 孵育30 min,DAB顯色8 min,脫水、透明、封片。每只動(dòng)物取兩張腦組織切片,400倍光鏡下隨機(jī)選取兩個(gè)視野,用HMIAS-2000進(jìn)行圖像分析,由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算出平均光密度值(mean optical density,MOD)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠皮質(zhì)區(qū) HIF-1α的mRNA表達(dá)

電泳條帶灰度掃描分析結(jié)果顯示,正常組、假手術(shù)組和缺氧缺血組皮質(zhì)HIF-1αmRNA的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05),而HIF-1αmRNA表達(dá)在孕酮組最高,明顯高于正常組、假手術(shù)組和缺氧缺血組(P＜0.01,表1,圖1)。

Tab.1 Image analysis of the expression of HIF-1αmRNA in cerebral cortex(±s,n=10)

Tab.1 Image analysis of the expression of HIF-1αmRNA in cerebral cortex(±s,n=10)

HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;PROG:Progesterone**P＜0.01 vs normal-control group;##P＜0.01 vs sham-operated group;△△ P＜0.01 vs hypoxic-ischemic group

Group Ratio of gray scale Normal-control 0.52±0.05 Sham-operated 0.51±0.06 Hypoxic-ischemic 0.52±0.06 PROG 0.78±0.06**##△△

Fig.1 Expression of HIF-1αmRNA in cerebral cortex

2.2 各組大鼠皮質(zhì)區(qū) HIF-1α蛋白表達(dá)

HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞分布在大腦皮質(zhì)和海馬,胞核和胞漿均有表達(dá),主要在胞核。正常對(duì)照組皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)極少量HIF-1α表達(dá),假手術(shù)組MOD值和正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05);缺氧缺血組皮質(zhì)區(qū)HIF-1α表達(dá)增加,MOD值明顯大于正常對(duì)照組(P＜0.01);孕酮組MOD值不僅明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01),亦高于缺氧缺血組(P＜0.05,表2,圖2見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅴ)。

Tab.2 Image analysis of the protein expression of HIF-1α in cerebral cortex(±s,n=10)

Tab.2 Image analysis of the protein expression of HIF-1α in cerebral cortex(±s,n=10)

HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;PR OG:Progesterone**P＜0.01 vs normal-control group;#P＜0.05 vs hypoxicischemic group

Group MOD value Normal-control 0.21±0.03 Sham-operated 0.21±0.02 Hypoxic-ischemic 0.38±0.03**PROG 0.55±0.04**#

3 討論

缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)廣泛參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng),是機(jī)體細(xì)胞適應(yīng)低氧的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。HIF-1是由α和β兩個(gè)亞單位組成的異二聚體,細(xì)胞內(nèi)的氧水平能夠調(diào)節(jié)HIF-1α亞單位的穩(wěn)定性、定位和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的功能,而β亞單位則在細(xì)胞核中持續(xù)表達(dá),其活性不受氧的影響[3]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常對(duì)照組可見(jiàn)有HIF-1αmRNA的表達(dá)和極少量的HIF-1α蛋白的表達(dá),與假手術(shù)組相比,無(wú)顯著性差異(P＞0.05),因而可以排除單純手術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。缺氧缺血組HIF-1αmRNA的表達(dá)與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05),但缺氧缺血組HIF-1α蛋白表達(dá)卻增加,明顯高于正常對(duì)照組及假手術(shù)組(P＜0.01)。可見(jiàn)缺氧并未引起HIF-1αmRNA的明顯上調(diào),但卻使HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增加,表明缺氧不是在基因水平,而是在蛋白水平影響HIF-1α的表達(dá)。Liu等[5]在培養(yǎng)的新生鼠皮質(zhì)神經(jīng)元觀察到了缺氧損傷引起的結(jié)果,而我們?cè)谡w動(dòng)物上加以驗(yàn)證,細(xì)胞水平和整體水平獲得的結(jié)果相一致。為什么缺氧時(shí)HIF-1αmRNA無(wú)變化,而HIF-1α蛋白表達(dá)卻明顯增加呢?在氧濃度正常的情況下,HIF-1α亞單位泛素化并經(jīng)泛素-蛋白酶小體途徑降解。而缺氧時(shí)脯氨酸羥化酶喪失功能,使HIF-1α不能被降解,并在核內(nèi)聚集,最后與HIF-1β結(jié)合,識(shí)別缺氧反應(yīng)靶基因啟動(dòng)子上的缺氧反應(yīng)元件(HREs),使其靶基因表達(dá)增強(qiáng)。也就是說(shuō)HIF-1α蛋白遇氧分解;而缺氧缺血時(shí)HIF-1α蛋白降解受阻,從而致 HIF-1α蛋白增加,而 HIF-1α mR NA則并未改變。

被稱為“神經(jīng)活性甾體”的PR OG,代謝產(chǎn)物具有麻醉,抗驚厥,抗焦慮和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)室也已證實(shí)PROG可明顯減少大鼠缺血側(cè)腦組織紋狀體的鈣含量,減輕細(xì)胞“鈣超載”,起到對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。也觀察到PROG可減輕新生鼠缺氧缺血性腦水腫[4]。且PROG可以通過(guò)上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)使腦內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)增加,以維持缺氧缺血腦組織的能量供給,從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[1,5],而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也是HIF-1的靶基因。目前有報(bào)道,HIF-1α至少能調(diào)節(jié)70多個(gè)靶基因的表達(dá):促進(jìn)糖酵解代謝基因表達(dá);促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá);影響內(nèi)皮素-1等基因的表達(dá)。這些變化使細(xì)胞、組織發(fā)生適應(yīng)性和保護(hù)性改變,以減輕缺氧缺血性損傷。我們的研究結(jié)果顯示,孕酮組大腦皮質(zhì)HIF-1α在蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯高于缺氧缺血組,孕酮對(duì)新生鼠缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用可能是通過(guò)其上調(diào)HIF-1α的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。由此我們推測(cè),HIF-1可能在PROG介導(dǎo)缺氧缺血的腦保護(hù)作用中處于重要地位?；蛟S這正是孕酮臨床防治缺氧缺血性腦病的價(jià)值所在。

[1]李東亮,趙紅崗,王東霞,等.孕酮對(duì)腦缺血再灌注大鼠紋狀體水,鈉,鉀及鈣含量的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2001,17(10):1012-1015.

[2]Ishrat T,Sayeed I,Atif F,et al.Effects of progesterone administration on infarct volume and functional deficits following permanent focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res,2009,1257:94-101.

[3]Chandel N S,Budinger G R.The cellular basis for diverse responses to oxygen[J].Free Radic Biol Med,2007,42(2):165-174.

[4]李 爽,徐春陽(yáng),姜洪波,等.孕酮對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織超氧化物歧化酶和基質(zhì)金屬蛋白酶3表達(dá)的影響[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2010,25(14):1056-1057.

[5]Liu J,Narasimban P,Yu F,et al.Neuroprotection by hypoxic preconditioning involves oxidative stress-mediated expression of hypoxia-inducible factor and erythropoietin[J].Stroke,2005,36(6):1264-1249.