任慧敏,謝瑞芹,崔 煒,劉 凡,劉 靜,呼海娟,魯靜朝

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科,石家莊 050000)

心肌缺血/再灌注損傷是臨床上比較常見的病理生理過程,因其較大的影響了再灌注的治療效果,而受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。1986年,Murry等[1]首次提出缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IPC)能減輕后續(xù)長(zhǎng)時(shí)間缺血/再灌注所引起的心肌損傷,認(rèn)為是一種有效的機(jī)體保護(hù)機(jī)制,并且已在多種動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械玫阶C實(shí)。然而,由于心肌缺血發(fā)生時(shí)間的不可預(yù)知性,缺血預(yù)處理在臨床中的應(yīng)用受到了極大限制。后來,Zhao等學(xué)者[2]提出缺血后處理(ischemic-postconditioning),并證明其與預(yù)處理有著相似的心臟保護(hù)作用。近年來,有學(xué)者提出了遠(yuǎn)端缺血后處理的概念,并進(jìn)行了一系列的研究,但骨骼肌缺血后處理對(duì)兔心肌缺血/再灌注壞死和凋亡的研究目前報(bào)道較少,本實(shí)驗(yàn)預(yù)對(duì)此進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性新西蘭大白兔,體重2 500～3 000 g,由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分3組:假手術(shù)組(Sham):僅開胸暴露心臟,左冠狀動(dòng)脈左室支中點(diǎn)處穿線,不結(jié)扎;缺血/再灌注組(ischemia/reperfusion,I/R):左冠狀動(dòng)脈左室支阻斷45 min后,開放再灌注120 min;遠(yuǎn)端后處理組(remote postcondationing,RPostC):在冠脈缺血/再灌注39 min時(shí)采取雙下肢髂外動(dòng)脈閉塞5 min,在心肌再灌注前1 min結(jié)束雙下肢后處理,心肌再灌注120 min。

1.2 主要試劑

Tunel試劑盒(南京建成生物工程研究所),Caspase-3兔免疫組化試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司),一抗Bcl-2,Bax兔抗IgG多克隆抗體(博士德生物技術(shù)有限公司),SP9001試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉生物科技有限公司),肌酸激酶試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司),乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。其余均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 心肌缺血/再灌注模型建立 以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉,氣管插管,接小動(dòng)物呼吸機(jī),用針形電極記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。在胸骨左緣3～5肋間開胸,暴露心臟。選擇左室支在左心耳下緣與心尖連線的中點(diǎn)穿線備用,硅膠管套線,束緊后在貼近硅膠管的上端用止血鉗將線夾緊,造成心肌缺血。結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)是心電圖導(dǎo)聯(lián)ST抬高,結(jié)扎冠脈遠(yuǎn)端心肌變紫。再灌注成功時(shí)變紫心肌恢復(fù)紅潤(rùn)。

1.3.2 雙下肢骨骼肌缺血/再灌注模型建立 在心肌缺血/再灌注模型制備之前,采用2%利多卡因局麻雙側(cè)腹股溝區(qū),直視下分離雙側(cè)髂外動(dòng)脈。應(yīng)用動(dòng)脈夾夾閉髂外動(dòng)脈固定位置以阻斷血流,以動(dòng)脈搏動(dòng)消失及恢復(fù)反映下肢缺血/再灌注情況。

1.3.3 心肌缺血區(qū)、壞死區(qū)范圍的檢測(cè) 于再灌注末在原位重新結(jié)扎左室支,從頸靜脈注入5%伊文思蘭4 ml,取下心臟,游離左心室,-20℃冷凍20 min固定心臟;將心臟沿著左心室(LV)長(zhǎng)軸均勻切為厚約2 mm的心肌8～9片。再分離無藍(lán)染的缺血區(qū)(ischemic zone,IZ)和藍(lán)染的非缺血區(qū)并照像。將心肌置于 1%TTC磷酸緩沖液中37℃孵育 10～15 min,可將灰白色的壞死區(qū)(necrotic zone,NZ)和深紅色的非壞死區(qū)分開,照相后分離缺血區(qū)、非缺血區(qū)及缺血區(qū)內(nèi)的壞死區(qū)和非壞死區(qū),將分離好的心肌用濾吸紙吸干后分別稱重,并通過圖像處理軟件(Photoshop及image-Pro Plus圖像處理系統(tǒng))計(jì)算各部分面積。以重量和面積兩種計(jì)量單位評(píng)價(jià)心肌缺血及壞死程度(缺血程度:缺血區(qū)重量/左室重量 ,以IZ/LVg表示,缺血區(qū)面積/左室面積 以IZ/LVs表示;壞死程度:壞死區(qū)重量/缺血區(qū)重量以NZ/IZg表示,壞死區(qū)面積/缺血區(qū)面積以NZ/IZs表示)。

1.3.4 血清心肌酶的測(cè)定 分別于結(jié)扎冠脈前、缺血45 min、再灌注60 min、120 min由頸動(dòng)脈抽血 2 ml,2 500 r/min,離心20 min分離血清,-80℃保存待測(cè)。分別檢測(cè)血清磷酸肌酸酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)。

1.3.5 凋亡心肌細(xì)胞檢測(cè) 用Tunel法,即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素(dUTP)切口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL assay)。于再灌注末,取缺血區(qū)心肌。組織大小為1 cm×1 cm×0.5 cm。取材后立即放人4%多聚甲醛液固定。用二甲苯常規(guī)脫蠟,梯度酒精入水重新水合,然后置PBS中5～10 min。TUNEL法標(biāo)記程序嚴(yán)格按試劑盒方法進(jìn)行。最后用蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片,顯微鏡觀察結(jié)果。凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒為Tunel陽性反應(yīng)。獨(dú)立取5個(gè)高倍鏡視野,計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。凋亡細(xì)胞指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.6 免疫組化法測(cè)caspase-3、Bcl-2及Bax的表達(dá)于再灌注末,取相應(yīng)缺血區(qū)心肌組織用4%多聚甲醛液固定。脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,3%雙氧水孵育,微波抗原修復(fù),正常山羊血清封閉,依次分別滴加1∶200抗兔caspase-3抗體,1∶100抗兔Bcl-2抗體及1∶100抗兔Bax抗體。生物素化二抗,SP復(fù)合物,DAB顯色,復(fù)染,脫水,透明,中性樹膠封片。計(jì)算caspase-3的表達(dá),于每張玻片上隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)。計(jì)算Bcl-2及Bax的表達(dá)通過CIAS-1000型計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng),每張切片隨機(jī)選10個(gè)視野,分別測(cè)定每組Bcl-2、Bax細(xì)胞陽性染色的平均光密度(OD值)與陽性細(xì)胞百分比,計(jì)算蛋白陽性表達(dá)指數(shù)(PEI),PEI=OD值×陽性細(xì)胞百分比×100,并計(jì)算Bax與Bcl-2的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

3組動(dòng)物在缺血前、缺血后45 min及再灌注60 min、120 min時(shí)的心率(HR)和平均動(dòng)脈壓(MAP)。

各組間HR和MAP在冠狀動(dòng)脈缺血前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在冠狀動(dòng)脈缺血期間,各組試驗(yàn)動(dòng)物的MAP呈下降趨勢(shì),但是這種變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

Tab.1 Hemodynamics during ischemia and reperfusion in three groups(±s,n=6)

Tab.1 Hemodynamics during ischemia and reperfusion in three groups(±s,n=6)

Isch45 min:End of 45 min LCX occlusion;R60 min:60 min after reperfusion;R120 min:120 min after reperfusion;HR:Heart rate;MAP:Mean arterial blood pressure;I/R:Ischemia/reperfusion;Rpost C:Remote postconditioning

Group Base Isch45 min R60 min R120 min HR(b/min)Sham 220±26 224±30 230±27 216±21 I/R 245±33 226±47 232±32 224±29 RpostC 233±16 221±16 228±13 235±12 MAP(mmHg)Sham 80±12 79±5 83±7 90±9 I/R 78±10 69±5 78±14 78±13 RpostC 83±5 80±7 90±10 93±8

2.2 心肌缺血和壞死范圍的測(cè)定

缺血/再灌注組與遠(yuǎn)端后適應(yīng)組W、LV及左室支結(jié)扎所造成的心肌缺血程度之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。遠(yuǎn)端后適應(yīng)組與缺血/再灌注組相比能夠顯著減少壞死程度:RPostC:NZ/IZg 19.4%±5.6%、NZ/IZs 17.11%±7.74%vsI/R:NZ/IZg 35.9%±6.3%、NZ/IZs 33.46%±8.05%(P＜0.05,表2)。

Tab.2 Comparison of W、LV and IZ/LV(%)、NZ/IZ(%)among three groups(±s,n=6)

Tab.2 Comparison of W、LV and IZ/LV(%)、NZ/IZ(%)among three groups(±s,n=6)

W:Weight;LV:Left ventricular mass;IZ:Ischemic zone;NZ:Necrotic zone;g:Gravity;s:Square metre*P＜0.05 vs I/R

Group W(Kg) LV(g) IZ/LV(g) IZ/LV(s) NZ/IZ(g) NZ/IZ(s)Sham 2.70±0.13 3.16±0.08 0 0 0 0 I/R 2.69±0.09 3.21±0.15 33.7±5.6 38.2±7.1 35.9±6.3 33.46±8.05 RpostC 2.73±0.16 3.19±0.23 31.5±3.7 36.7±4.8 19.4±5.6* 17.11±7.74*

2.3 血清CK和LDH的測(cè)定

各組動(dòng)物缺血前、缺血后、再灌注60 min及再灌注120 min測(cè)得血清CK及LDH。各組缺血前CK及LDH均無差異。RPostC較缺血/再灌注組能夠減少再灌注120 min末CK釋放RPostC:CK 3997±865 U/LvsI/R:CK 6885±1202 U/L(P＜0.05),但LDH未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3)。

Tab.3 Comparison of CK(U/L)and LDH(U/L)among three groups(±s,n=6)

Tab.3 Comparison of CK(U/L)and LDH(U/L)among three groups(±s,n=6)

*P＜0.05 vs I/R;#P＜0.05 vs sham

Group Base Isch45 min R60 min R120 min CK(U/L)Sham 1810±451 1759±450 1880±562 1785±490 I/R 1804±499 2050±591 3833±894 6885±1202 RpostC 1839±661 1982±725 3114±7883997±865*LDH(U/L)Sham 186±67 189±44 181±42 180±47 I/R 165±85 185±100 274±102 324±89#RpostC 195±79 226±88 252±70 294±95#

2.4 HE染色結(jié)果

Sham組心肌細(xì)胞大小形態(tài)無變化,橫紋清晰,胞核正常,只有少數(shù)區(qū)域間質(zhì)充血。I/R組心肌細(xì)胞體積明顯增大、水腫,廣泛空泡變性。胞漿染色淡。少數(shù)區(qū)域的心肌纖維斷裂;胞核明顯增大,染色淺;間質(zhì)充血、水腫,血管明顯擴(kuò)張。RPostC組的心肌細(xì)胞體積略增大,少數(shù)細(xì)胞內(nèi)空泡變性;胞漿染色較正常略淡,心肌橫紋局灶性消失,胞核小、染色無明顯變化,心肌細(xì)胞染色較I/R組深,部分區(qū)域間質(zhì)充血,少數(shù)區(qū)域血管周圍有炎性細(xì)胞滲出(圖1)。

2.5 Tunel檢測(cè)結(jié)果

凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈Tunel陽性反應(yīng),為棕褐色或棕黃色顆粒(圖2)。假手術(shù)組兔心肌組織只有少量凋亡細(xì)胞,缺血/再灌注組缺血區(qū)出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,凋亡指數(shù)為35.81%±1.10%,遠(yuǎn)端后處理組缺血區(qū)心肌凋亡指數(shù)為21.79%±1.07%,顯著低于缺血/再灌注組(P＜0.05,表4)。

Fig.1 Myocardial cell shape(HE ×200)

Fig.2 Tunel test results(TUNEL ×400)

2.6 Caspase-3的表達(dá)

與假手術(shù)組4.57%±1.72%比較,缺血/再灌注組caspase-3陽性細(xì)胞指數(shù)明顯增加,39.00%±2.43%(P＜0.05);而RPostC組的陽性細(xì)胞指數(shù)25.03%±1.16%與缺血/再灌注組比較顯著減小(P＜0.05,表 4)。

Tab.4 Tunel and caspase-3 positive cells index(%,±s,n=6)

Tab.4 Tunel and caspase-3 positive cells index(%,±s,n=6)

*P＜0.05 vs Sham;#P＜0.05 vs I/R

Group Tunel Caspase-3 Sham 3.22±0.70 4.57±1.72 I/R 35.81±1.10* 39.00±2.43*RpostC 21.79±1.07*# 25.03±1.16*#

2.7 Bcl-2及Bax的表達(dá)

與Sham組比較,I/R組及RPostC組Bax蛋白表達(dá)指數(shù)、Bcl-2蛋白表達(dá)指數(shù)均升高,RPsotC組的Bax/Bcl-2比值降低,而I/R組的Bax/Bcl-2比值升高。與I/R組相比較,RPostC組Bax蛋白表達(dá)指數(shù)及Bax/Bcl-2比值顯著降低,Bcl-2表達(dá)指數(shù)顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,表5)。

Tab.5 Bcl-2 and Bax protein expression ratio(±s,n=6)

Tab.5 Bcl-2 and Bax protein expression ratio(±s,n=6)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R

Group Bcl-2 Bax Bax/Bcl-2 Sham 0.36±0.07 0.31±0.02 0.84±0.72 I/R 5.81±1.70* 16.85±2.43* 3.37±0.28*RpostC 14.79±1.07*# 4.03±1.16*# 0.27±0.46*#

3 討論

急性心肌梗死是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病。溶栓或直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)等再灌注治療可以有效恢復(fù)冠脈血流,減少心肌梗死面積,但在再灌注治療的同時(shí)也會(huì)帶來再灌注損傷,表現(xiàn)在促進(jìn)缺血心肌的凋亡[3],加重心肌的損傷[4]等。因此,再灌注損傷明顯影響了血管開通的治療的效果。缺血預(yù)處理及后處理均是機(jī)體的有效保護(hù)機(jī)制,其心臟保護(hù)作用已經(jīng)在犬、兔和鼠等動(dòng)物模型上得到了證實(shí)[2,5,6]。缺血后處理的心肌保護(hù)作用不僅可以通過心臟本身的反復(fù)缺血/再灌注而獲得,還可以通過心臟外器官如腎動(dòng)脈、肢體動(dòng)脈及腸系膜動(dòng)脈等來實(shí)現(xiàn)。通過其短暫的缺血/再灌注而產(chǎn)生類似的心臟保護(hù)效應(yīng),即遠(yuǎn)端缺血后處理。2005年,Kerendi等[7]人證實(shí)在心肌缺血/再灌注末實(shí)施的短暫性腎臟缺血/再灌注能夠顯著的減少心肌梗死的面積。然而,作為一種外周器官,骨骼肌具有操作方便、耐受力強(qiáng)等特點(diǎn),但骨骼肌遠(yuǎn)端缺血后處理對(duì)心肌壞死和凋亡的影響目前的研究和報(bào)道較少。

關(guān)于遠(yuǎn)端缺血后處理的作用機(jī)制,已有大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。Kerendi等提出這種遠(yuǎn)端器官提供的保護(hù)作用(腎對(duì)心臟),可能與腎缺血/再灌注引起腺苷(ADO)的釋放有關(guān),隨后又激活了心臟腺苷受體。Liu等[8]在對(duì)兔腎臟的研究中發(fā)現(xiàn),遠(yuǎn)端腎臟的缺血后處理減少了心臟缺血/再灌注的心肌細(xì)胞的凋亡,同時(shí)上調(diào)Bcl-2的表達(dá),下調(diào)Bax的表達(dá),此作用可能與蛋白激酶C(PKC)的激活有關(guān)。

心肌的損傷包括心肌細(xì)胞的壞死和凋亡,其中壞死是主要的表現(xiàn)形式,但凋亡在細(xì)胞損傷過程中同樣起著極其重要的作用。細(xì)胞凋亡是一個(gè)由多種因素引起的復(fù)雜過程,受多種蛋白因子的調(diào)控,其中caspase-3(半胱天冬酶-3)和Bcl-2水平的高低是決定細(xì)胞凋亡的重要因素。在凋亡階段,caspase-3主要負(fù)責(zé)對(duì)關(guān)鍵性蛋白的酶切,caspase-3一旦被激活,細(xì)胞凋亡的發(fā)生就將不可逆轉(zhuǎn)。Sun等[9]在肝缺血/再灌注模型中發(fā)現(xiàn)在缺血后處理中Bcl-2蛋白明顯提高而且凋亡指數(shù)顯著下降,進(jìn)而提出后處理可通過促進(jìn)抑凋亡基因Bc1-2的表達(dá)、抑制凋亡執(zhí)行者caspase-3酶的活性,從而抑制再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示,在冠狀動(dòng)脈再灌注早期給予兔雙下肢髂外動(dòng)脈短暫缺血/再灌注能夠明顯減輕兔心肌缺血/再灌注損傷,減少血清CK的釋放,同時(shí)也明顯地減小了心肌梗死的程度。此結(jié)果與Li等[10]在兔骨骼肌后處理模型中的研究結(jié)果相一致,其可能與減少氧自由基釋放,增強(qiáng)抗氧化功能有關(guān)。同時(shí),骨骼肌缺血后處理不僅減少caspase-3的表達(dá),還減少Bax/Bcl-2的表達(dá)比例,增加Bcl-2的表達(dá),而Bcl-2是一個(gè)抑制細(xì)胞凋亡的重要因素,其能夠在多階段、多層次阻斷細(xì)胞凋亡的進(jìn)程?？梢砸种凭€粒體的破裂,阻止凋亡執(zhí)行者caspase-3的激活物細(xì)胞色素C的釋放,還可直接與凋亡蛋白酶激活因子1結(jié)合,使caspase-3無法激活,從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。

由此可以看出,骨骼肌遠(yuǎn)端缺血后處理不僅減少了心肌壞死的程度,而且減少了缺血/再灌注心肌缺血區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡。推測(cè)其原因,骨骼肌的缺血后處理抑制了兔心肌缺血/再灌注早期啟動(dòng)的凋亡程序,抑制了其促凋亡基因caspase-3的表達(dá),促進(jìn)了抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá),減少了Bax/Bcl-2的蛋白表達(dá)比例,從而抑制了凋亡的進(jìn)程。骨骼肌遠(yuǎn)端缺血后處理對(duì)心肌細(xì)胞的壞死和凋亡都有著有效的控制作用,這為骨骼肌遠(yuǎn)端后處理能夠應(yīng)用于臨床提供了可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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