趙煥新,李曉宇,武 燁,王曉木梁,趙榮瑞,劉慧榮

(1.山西中醫(yī)學(xué)院生理教研室,太原 030024;2.山西醫(yī)科大學(xué),太原 030001;3.首都醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理學(xué)系,北京 100069)

缺血性心臟病嚴(yán)重危害著人類健康,目前臨床對(duì)于缺血性心臟病的治療主要采取解痙、溶栓等方法以盡早恢復(fù)缺血區(qū)的血液再灌,但是再灌注本身會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生額外損傷即再灌注損傷。已有研究證實(shí)[1],缺血后處理(ischemic postconditioning,PostC)能夠明顯減輕缺血/再灌注導(dǎo)致的心肌損傷。但是在臨床上,冠脈梗塞所致的心肌缺血多發(fā)生于老年人,且常常伴有高膽固醇血癥(hypercholesteremia,HC),而高膽固醇血癥會(huì)明顯加重缺血/再灌注造成的心肌損傷。關(guān)于缺血后處理能否同樣減輕高膽固醇血癥基礎(chǔ)發(fā)生的心肌缺血/再灌注損傷及其可能的機(jī)制,目前研究尚不明確。因此,本研究通過(guò)建立食源性高膽固醇血癥但不發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的大鼠模型,旨在探討缺血后處理對(duì)高膽固醇血癥基礎(chǔ)上發(fā)生的心肌缺血/再灌注損傷的影響,以及低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

Even's blue和 TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑):Sigma;肌酸激酶(creatine kinase,CK)檢測(cè)試劑盒:南京建成生物工程研究所;血清甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)檢測(cè)試劑盒:中生北控生物科技股份有限公司;caspase-3活性檢測(cè)試劑盒:BIOMOL,USA;HIF-1α兔多克隆抗體、β-Actin兔多克隆抗體:Santa Cruz

1.2 模型建立

1.2.1 高膽固醇血癥大鼠模型建立 健康雄性Wistar大鼠60只,體重(120±10)g,分為兩組(n=30):普通飲食組(普通飼料喂養(yǎng)8周),高脂飲食組(高脂飼料[2]喂養(yǎng)8周)。定期稱量大鼠體重,于8周時(shí)鼠尾采血測(cè)定血脂水平。成模標(biāo)準(zhǔn):以TC、TG、LDL水平與正常飲食組相比顯著升高(P＜0.05)為成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 大鼠心肌缺血/再灌注和缺血后處理模型建立 喂養(yǎng) 8周后的大鼠,參照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法[2,3],結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支造成左心室缺血,以心電圖出現(xiàn)ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形為結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)扎30 min(即缺血30 min)后,松開結(jié)扎線恢復(fù)冠脈血液灌注并持續(xù)(即再灌注)3 h。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支缺血30 min后,松開結(jié)扎線10 s,再次結(jié)扎進(jìn)行缺血10 s,依此重復(fù)三次,然后持續(xù)再灌3 h(即缺血后處理)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)共分6組(n=10):(1)正常飲食-偽手術(shù)組(N-sham,):僅在冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)下穿線,不結(jié)扎,持續(xù) 210 min;(2)正常飲食-缺血/再灌注組(N-I/R):缺血30 min,再灌注3 h;(3)正常飲食-缺血后處理組(N-PostC):結(jié)扎LAD 30 min,隨即進(jìn)行10 s再灌注+10 s缺血,重復(fù)3次,隨后再進(jìn)行3 h再灌注;(4)高膽固醇血癥-偽手術(shù)組(HC-sham):手術(shù)操作同(1);(5)高膽固醇血癥-缺血/再灌注組(HC-I/R):手術(shù)操作同(2);(6)高膽固醇血癥-缺血后處理組(HC-PostC):手術(shù)操作同(3)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 心梗面積測(cè)定 參考本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法[2,3],于再灌注結(jié)束后再次結(jié)扎LAD,經(jīng)股靜脈注入2%Even's blue后快速取出心臟,將左心室垂直于心腔縱軸方向自心底向心尖平均切成六片環(huán)形的薄片,在37℃于 1%TTC中避光孵育15min,用10%福爾馬林固定。正常的心肌組織被染成藍(lán)色,缺血區(qū)的心肌組織被染為紅色,梗死的心肌組織為白色。用掃描儀對(duì)心臟切面進(jìn)行掃描,利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分別測(cè)定藍(lán)色、紅色和白色區(qū)域面積。缺血區(qū)面積(AAR/LV,%)=(缺血區(qū)總面積/左心室面積)×100%;心梗面積(An/AAR,%)=(梗死區(qū)面積/缺血區(qū)總面積)×100%

1.4.2 血清CK活性的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,室溫靜置30 min,1 000 r/min離心15 min,取血清,采用南京建成生物工程研究所的CK檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 心肌組織caspase-3相對(duì)活性的測(cè)定 心肌組織充分裂解后于4℃、10 000×g離心10 min,取50 μ l上清與底物于37℃孵育1.5 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)其光密度(OD)值。用蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化校正OD值,以sham組的活性為1,計(jì)算其余各組的相對(duì)活性(比活性)。

1.4.4 實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定心肌組織HIF-1αmRNA的表達(dá) 再灌注結(jié)束后取缺血區(qū)心肌組織約50 mg,參照文獻(xiàn)方法提取總 RNA、每個(gè)樣品取3 μ g總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后,于Mx3005實(shí)時(shí)定量PCRSystem上進(jìn)行擴(kuò)增 ,選用 β-actin 作為對(duì)照 。 采用 2-ΔΔCt法對(duì)HIF-1α mRNA進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。

1.4.5 Western-blot方法檢測(cè)心肌組織HIF-1α的蛋白水平 再灌注結(jié)束后取缺血區(qū)心肌組織約50mg,參照文獻(xiàn)方法,反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)DAB顯色,掃描目的條帶,采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行積分光密度(IOD)測(cè)量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食喂養(yǎng)8周后大鼠血脂水平明顯增加

如表1所示,給予高脂飼料前,60只大鼠的血脂水平無(wú)明顯差異,其中30只經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)后,血脂水平較8周前顯著提高,其血清中TC、TG及LDL水平顯著高于同期普通飲食喂養(yǎng)的大鼠血脂水平(P＜0.01),表明高脂模型建立成功。

2.2 高膽固醇血癥增加了心肌對(duì)缺血/再灌注損傷的敏感性

心肌缺血/再灌注后,正常飲食大鼠心肌梗死面積(梗死區(qū)面積/缺血區(qū)總面積,An/AAR,圖1A)為33.4%±1.4%,而高膽固醇血癥大鼠心肌梗死面積達(dá)39.5%±1.2%,高膽固醇血癥使缺血/再灌注造成的心梗面積略有所增加。此外,與正常飲食大鼠相比,高膽固醇血癥使缺血/再灌注大鼠血清CK活性進(jìn)一步增加(高膽固醇血癥組0.56±0.06 U/mlvs正常飲食組0.47±0.04 U/ml,P＜0.01,圖1B)。與上述結(jié)果一致,缺血/再灌注導(dǎo)致的高膽固醇血癥大鼠心肌caspase-3活性(4.63±0.42)比正常飲食大鼠caspase-3活性(2.31±0.27,P＜0.01,圖1C)增加更加顯著。

以上結(jié)果提示,高膽固醇血癥增加了心肌對(duì)缺血/再灌注損傷的敏感性。

Tab.1 Plasma lipid level of baseline and after fed for 8 weeks(mmol/L,±s,n=30)

Tab.1 Plasma lipid level of baseline and after fed for 8 weeks(mmol/L,±s,n=30)

TC:Total cholesterol;TG:Triglyceride;LDL:Low density lipoprotein**P＜0.01 vs normal diet group

Group Baseline After fed for 8weeks TC TG LDL TC TG LDL Normal diet group 2.82±0.50 0.64±0.15 0.88±0.19 2.70±0.96 1.01±0.08 1.00±0.19 High fat diet group 2.92±0.47 0.64±0.21 0.90±0.16 4.10±0.61** 1.36±0.39** 1.73±0.57**

2.3 缺血后處理顯著減輕了高膽固醇血癥大鼠缺血/再灌注所致的心肌損傷

如圖1A所示,在正常飲食組和高膽固醇血癥組,缺血后處理均可縮小缺血/再灌注導(dǎo)致的心肌梗死面積(正常飲食組:24.8%±1.8%vs33.4%±1.4%,P＜0.05;高膽固醇血癥組:29.7%±3.5%vs39.5%±1.2%,P＜0.01),降低血清CK活性(圖1B)及心肌組織 caspase-3活性(圖 1C),且兩組減小程度均無(wú)明顯差異。以上結(jié)果提示,不論是正常組或高膽固醇血癥組,缺血后處理都可以有效減輕缺血/再灌注造成的心肌損傷。

2.4 缺血后處理提高了高膽固醇血癥大鼠缺血/再灌注心肌組織HIF-1α的蛋白水平

Western-blot方法檢測(cè)缺血/再灌注心肌組織中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平的結(jié)果顯示,缺血/再灌注使高膽固醇血癥大鼠心肌組織中HIF-1α的蛋白含量明顯增加,達(dá)到偽手術(shù)組的1.81倍;而給予缺血后處理后,HIF-1α的蛋白水平進(jìn)一步提高,為偽手術(shù)組的3.02倍(P＜0.01,圖2)。結(jié)果提示,心臟經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間缺血之后,缺血后處理仍然可以觸發(fā)HIF-1α蛋白的表達(dá)。用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)各組大鼠心肌組織HIF-1α mRNA的表達(dá),結(jié)果表明,心肌組織中HIF-1α mRNA水平在各組大鼠間無(wú)明顯差異。

2.5 心肌組織HIF-1α蛋白水平與心梗面積之間的相關(guān)性分析

我們對(duì)高膽固醇血癥大鼠心肌組織HIF-1α的蛋白表達(dá)水平與作為反映心肌缺血/再灌注損傷的金指標(biāo)---心梗面積之間作了相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,HIF-1α的蛋白水平與心梗面積呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.802,P＜0.01,圖3)。

3 討論

高膽固醇血癥是缺血性心臟病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中最主要的一個(gè)危險(xiǎn)因素。流行病學(xué)研究顯示,血清總膽固醇濃度升高與心肌梗死的發(fā)病率和死亡率之間存在著顯著的相關(guān)性。Osipov等[4]對(duì)高膽固醇飲食喂養(yǎng)16-20周的豬進(jìn)行缺血/再灌注的研究發(fā)現(xiàn),高膽固醇血癥顯著加重了缺血/再灌注所致的心肌梗死和心肌細(xì)胞凋亡。本研究在食源性高膽固醇血癥大鼠模型中也觀察到,高膽固醇血癥使缺血/再灌注造成的心肌梗死面積進(jìn)一步擴(kuò)大,血清CK活性及心肌細(xì)胞凋亡明顯增加,這些結(jié)果均說(shuō)明高膽固醇血癥增加了心肌組織對(duì)缺血/再灌注損傷的易感性。

2003年Zhao等[1]在對(duì)犬進(jìn)行心肌缺血/再灌注的研究中首次提出了“缺血后處理”(ischemic postconditioning,PostC)的概念,發(fā)現(xiàn)缺血后處理可以明顯減輕再灌注造成的心肌損傷。目前,缺血后處理的效應(yīng)已經(jīng)在動(dòng)物模型[5]和臨床觀察[6]中得到證實(shí)。但是值得注意的是,目前對(duì)缺血后處理減輕再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究大都是采用健康動(dòng)物作為模型,而缺血后處理對(duì)于伴發(fā)高膽固醇血癥的心肌缺血/再灌注損傷是否同樣具有保護(hù)效應(yīng),還存在爭(zhēng)議。Martin等[7]在對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)的兔進(jìn)行心臟離體灌流時(shí)觀察到,缺血后處理通過(guò)激活A(yù)1受體和KATP通道可以減小心肌梗死面積;而Iliodromitis[8]等則在高膽固醇血癥伴動(dòng)脈粥樣硬化的兔模型上發(fā)現(xiàn)缺血后處理并不能改善缺血/再灌注造成的心肌梗死。類似的研究大多是利用兔建立高膽固醇血癥模型后對(duì)心臟進(jìn)行離體灌流,而且在研究時(shí)該模型高膽固醇血癥基本上已發(fā)展為不同程度的動(dòng)脈粥樣硬化。因此這些研究結(jié)果提示,動(dòng)脈粥樣硬化的不同進(jìn)程可能影響了對(duì)缺血后處理效應(yīng)的研究。為此,我們?cè)谘芯恐欣么笫蠼⒘耸吃葱愿吣懝檀佳Y但不發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的模型[9],結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血后處理同樣可以縮小高膽固醇血癥大鼠缺血/再灌注所致的心肌梗死面積、減少心肌細(xì)胞凋亡。

Fig.1 Effects of ischemia/reperfusion and ischemic postconditioning onmyocardial injury in both normal and hypercholesteremic rats

缺血后處理的心肌保護(hù)機(jī)制可能涉及多種因素、多條途徑共同參與,但是在眾多機(jī)制中究竟哪一種因素起始發(fā)、主導(dǎo)作用還不清楚。有研究表明[10],HIF-1α作為氧平衡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子,其表達(dá)增加可能是心肌缺血/再灌注過(guò)程中最早期的分子水平上的適應(yīng)性反應(yīng),可以增強(qiáng)心肌對(duì)抗缺血/再灌注損傷的能力。在本研究中我們檢測(cè)了高膽固醇血癥大鼠缺血后處理心肌組織中HIF-1α的蛋白水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血后處理進(jìn)一步上調(diào)了HIF-1α的蛋白表達(dá)水平,而且隨著HIF-1α蛋白水平增加,缺血/再灌注造成的心肌梗死面積明顯減小,二者之間呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示,HIF-1α可能是缺血后處理減輕高膽固醇血癥大鼠心肌缺血/再灌注損傷的機(jī)制之一。

Fig.2 Effect of ischemic postconditioning on the expression of HIF-1αprotein level in hypercholesteremic rats

Fig.3 Linear analysis between infarct size(An/AAR)and HIF-1αprotein expression

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