張 輝，李金玲，王永勝，張聰聰，徐曉玉（西南大學(xué)藥學(xué)院/重慶市藥效評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，重慶400715）

銀天顆粒是本課題組研制的中藥復(fù)方保健品，主要用于防治春夏之交瘟疫流行、熱毒所傷；或夏季傷暑、煩熱口渴；或嗜食香燥、火毒內(nèi)生等。它是本課題組科技扶貧項(xiàng)目“秀山金銀花產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)”的產(chǎn)業(yè)鏈深加工產(chǎn)品，是從秀山灰氈毛忍冬（山銀花）、梔子等物質(zhì)中提取的有效成分制成的一種藥食兩用保健品，已經(jīng)申報(bào)國(guó)家技術(shù)發(fā)明專(zhuān)利，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。其中，山銀花主要功效成分為綠原酸，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽等藥理作用[1，2]。梔子的主要功效成分為梔子苷，具有抗炎利膽、抗腫瘤、降血糖等多種藥理作用[3，4]。為了更好地控制銀天顆粒的質(zhì)量，本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對(duì)其主要藥效成分綠原酸和梔子苷進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1200Series型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）；EL-2046型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

綠原酸、梔子苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110753-200413、110749-200714）；銀天顆粒（西南大學(xué)中藥研究所研制，規(guī)格：2g/袋，批號(hào)：2010092801、2010092802、2010092803）；乙腈、磷酸為色譜純，甲醇為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 RP-HPLC法測(cè)定銀天顆粒中綠原酸的含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Platisil-ODS（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸（20∶80）；流速：1.0mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：326nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.1.2 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品0.0108g，置于100mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，即得濃度為108.0μg·mL－1的對(duì)照品貯備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取銀天顆粒適量，研成細(xì)粉，取0.3g，精密稱(chēng)定，置25mL棕色容量瓶中，加50%甲醇20mL，超聲處理（工作頻率：40kHz，功率：220W）30min，放冷至室溫，加50%甲醇定容，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液1mL，置5mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻。用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方量制備僅含輔料的顆粒作為陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果表明，陰性對(duì)照對(duì)綠原酸的測(cè)定無(wú)干擾；綠原酸的保留時(shí)間為5.5min，峰形良好，與其他組分峰分離較好；理論板數(shù)不低于5000，分離度均＞4。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 綠原酸的HPLC圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.綠原酸Fig 1 HPLC chromatograms of chlorogenic acidA.substance control；B.test samples；C.negative control；1.chlorogenic acid

2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取綠原酸對(duì)照品貯備液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mL，置10mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。以綠原酸濃度（c，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝11.022c－5.5739（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，綠原酸檢測(cè)濃度在5.4～108.0μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取綠原酸對(duì)照品溶液（21.6μg·mL－1）適量，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.15%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、24h按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝1.79%（n＝6），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)：2010092803）適量，共6份，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸的含量。結(jié)果，6份樣品中綠原酸的平均含量為11.08mg·g－1，RSD＝0.16%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的同一批次樣品（批號(hào)：2010092803，綠原酸含量：11.08mg·g－1）適量，共6份，分別精密加入適量的綠原酸對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，綠原酸的平均回收率為99.04%，RSD＝2.66%（n＝6）。

2.1.11 樣品含量測(cè)定 按上述方法測(cè)定3批樣品（批號(hào)：2010092801、2010092802、2010092803）含量，各平行操作 3份。結(jié)果，3批樣品中綠原酸的平均含量分別為11.32、11.81、11.08mg·g－1（n＝3）。

2.2 RP-HPLC法測(cè)定銀天顆粒中梔子苷的含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（10∶90）；檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm；流速：1.0mL·min－1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2.2 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱(chēng)取梔子苷對(duì)照品0.0110g，置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得濃度為110μg·mL－1的對(duì)照品貯備液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取銀天顆粒適量，研成細(xì)粉，取3g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，搖勻，稱(chēng)重，超聲處理（工作頻率：40kHz，功率：220W）30min，放冷至室溫，再稱(chēng)重，加甲醇補(bǔ)足失重，密塞，搖勻。用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方量制備僅含輔料的顆粒作為陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取供試品、對(duì)照品和陰性對(duì)照溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果表明，陰性對(duì)照對(duì)梔子苷的測(cè)定無(wú)干擾；梔子苷的保留時(shí)間為19.2min，峰形良好，與其他組分峰分離較好；理論板數(shù)不低于4000，分離度均＞4。色譜見(jiàn)圖2。

圖2 梔子苷的HPLC圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.梔子苷Fig 2HPLC chromatograms of gasminoidinA.standard sample；B.test samples；C.negative control；1.gasminoidin

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取梔子苷對(duì)照品貯備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)后按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。以梔子苷濃度（c，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝25.583c+4.8044（r＝0.9999，n＝6）。結(jié)果表明，梔子苷的檢測(cè)濃度在11～110μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取梔子苷對(duì)照品溶液（55μg·mL－1）適量，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.45%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，分別于0、0.5、2、4、8、12h按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝2.06%（n＝6），表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)：2011092802）適量，共6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定梔子苷的含量。結(jié)果，6份樣品中梔子苷的平均含量為0.168mg·g－1，RSD＝0.82%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的同一批次樣品（批號(hào)：2011092803，梔子苷含量：0.178mg·g－1）適量，共6份，分別精密加入適量的梔子苷對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，梔子苷的平均回收率為97.69%，RSD＝2.07%（n＝6）。

2.2.11 樣品含量測(cè)定 按上述方法測(cè)定3批樣品（批號(hào)：2010092801、2010092802、2010092803）含量，各平行操作3份。結(jié)果，梔子苷的平均含量分別為0.147、0.168、0.178mg·g－1。

3 討論

為了控制銀天顆粒中山銀花和梔子的含量，筆者參照藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[5～8]，分別建立了銀天顆粒中綠原酸、梔子苷含量測(cè)定的RP-HPLC法。結(jié)果表明，在本試驗(yàn)所選的色譜條件下，銀天顆粒中藥用輔料對(duì)綠原酸、梔子苷的含量測(cè)定無(wú)干擾，目標(biāo)成分峰形良好，且能與其他組分峰較好地分離。2種方法均具有回收率高、重復(fù)性好、分析快速、結(jié)果準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可用于銀天顆粒的質(zhì)量控制。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：28.

[2] 王 輝，田呈瑞，馬守磊，等.綠原酸的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2009，30（5）：341.

[3] 倪慧艷，張俊慧，傅海珍.中藥梔子的研究與開(kāi)發(fā)概述[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31（7）：538.

[4] 李葆華.梔子的研究概況[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，33（5）：583.

[5] 徐 玲，張繼芬，吳芳洲，等.HPLC法測(cè)定雙花顆粒中綠原酸的含量[J].中國(guó)藥房，2011，22（23）：2156.

[6] 陳 輝.HPLC法測(cè)定復(fù)方感冒顆粒中綠原酸的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（5）：583.

[7] 孫文武.HPLC法測(cè)定梔柏合劑中梔子苷的含量[J].中國(guó)藥房，2007，18（33）：2609.

[8] 筆雪燕，劉曉鳳，張清波.HPLC法測(cè)定清開(kāi)靈泡騰片中梔子苷的含量[J].中國(guó)藥房，2011，22（8）：240.