唐俊龍，王朝元，劉 介

（中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074）

1 引言

骨包括有機(jī)相（非膠原蛋白和膠原）和無機(jī)相，羥基磷灰石（HA）是骨無機(jī)相的主要成分，約占干骨組織的45%。用HA來做骨植入材料不僅生物相容性高、機(jī)械性能好、化學(xué)性能穩(wěn)定，還能明顯的促進(jìn)骨的生長，故長期以來作為生物活性材料。但純HA因脆性大、抗疲勞性強(qiáng)度不高、難以降解［1］等缺點(diǎn)限制了臨床應(yīng)用。聚已內(nèi)酯（PCL）是線性的脂肪聚酯，具有良好的生物降解性和相容性［2］，但其強(qiáng)度低難以滿足骨植入材料的要求。因此，我們制成納米羥基磷灰石／聚已內(nèi)酯（nHA／PCL）復(fù)合材料，它結(jié)合了兩種材料的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的生物相容性并能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖［3］，有望成為一種具有臨床前景的新穎骨替換材料。李家峰，萬美蓉［4］等的研究顯示人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)nHA／PCL過納米羥基磷灰石／聚已內(nèi)酯復(fù)合物誘導(dǎo)后其骨相關(guān)基因mRNA的表達(dá)上調(diào)。說明HA的加入可以提高惰性材料的生物活性，nHA／PCL可以預(yù)期，納米羥基磷灰石／聚已內(nèi)酯復(fù)合物具有良好的體內(nèi)成骨作用。

本文集中探討不同配比納米羥基磷灰石／聚已內(nèi)酯（nHA∶PCL＝0∶100、nHA∶PCL1＝40∶60、nHA∶PCL2＝60∶40）對成骨細(xì)胞骨相關(guān)基因表達(dá)的影響，能從分子水平了解HA在復(fù)合材料中的作用和影響成骨細(xì)胞的分子機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和儀器

nHA／PCL復(fù)合材料（華東理工大學(xué)生物材料研究所），小鼠成骨細(xì)胞株（MC3T3－E1，上海細(xì)胞生物研究所），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），新生牛血清（杭州四季清）、青霉素（BIOSHARP）、鏈霉素（BIOSHARP），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），胰蛋白酶（Amresco），二甲基亞砜（Amresco），ALP試劑盒（南京建成生物科技公司），Trizol（Invitrogen），PCR 引物（武漢 博越 技術(shù) 有限 公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）。CO2培養(yǎng)箱（HF90／240型，利康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)），倒置顯微鏡（Motic AE21型，重慶光學(xué)儀器），普通PCR儀（Biometra，德國），凝膠成像分析儀 （JS－380A，上海培清科技）。

2.2 原代小鼠顱骨成骨細(xì)胞（PMO）培養(yǎng)

將新生昆明種小鼠頭顱剪碎，0.25%胰酶消化后，加入5mL培養(yǎng)基（含10%新生牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素），1500r／min離心5min沉淀細(xì)胞，棄上清，加培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中于37℃、5%CO2飽和度條件下培養(yǎng)。

2.3 nHA／PCL復(fù)合材料的制備

nHA和PCL按0∶100；40∶60；60∶40不同比例混勻，PCL在15MPa壓力下3min形成片狀。用砂紙打磨材料片表面并漂洗干凈，濕熱滅菌后備用。

2.4 不同配比nHA／PCL復(fù)合物對骨相關(guān)基因表達(dá)

將細(xì)胞以2×105個／cm2濃度接種于培養(yǎng)皿中的nHA／PCL片上，并以同樣濃度的細(xì)胞接種于普通玻璃培養(yǎng)瓶中作為空白對照。靜置2h，讓細(xì)胞貼壁。每皿加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基將材料片浸沒，置培養(yǎng)皿于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4d換1次培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)2、6、12d的細(xì)胞。Trizol法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成為cDNA，以cDNA為模板，用骨相關(guān)基因引物（表1）進(jìn)行普通PCR。PCR反應(yīng)條件：94℃，3min；94℃，30s，60℃，30s，68℃，90s，30個循環(huán)；68℃，5min。以 GAPDH 為內(nèi)參基因，通過2%瓊脂糖凝膠電泳來確定骨相關(guān)基因的表達(dá)差異。用SensiAnsys軟件對目標(biāo)基因與GAPDH灰度比來計(jì)算表達(dá)量。

表1 骨相關(guān)基因PCR擴(kuò)增的引物序列

3 結(jié)果與分析

3.1 不同材料對骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

3.1.1 不同材料對成骨細(xì)胞OP基因表達(dá)的影響

不同材料片對成骨細(xì)胞OP基因mRNA表達(dá)的影響見圖1。由圖1可見，經(jīng)2、6、12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片在PMO細(xì)胞的上生長的成骨細(xì)胞的OP基因表達(dá)量高于對照和PCL材料片上的OP基因表達(dá)量或者接近，而PCL材料片上生長的細(xì)胞OP基因表達(dá)量要低于對照組（圖1a）。在 MC3T3－E1細(xì)胞的OP基因系中也有相同趨勢（圖1b）。

圖1 nHA／PCL and PCL對PMO和MC3T3－E1細(xì)胞OP表達(dá)的影響

3.1.2 不同材料對成骨細(xì)胞ON基因表達(dá)的影響

不同材料片對成骨細(xì)胞ON基因表達(dá)的影響見圖2。由圖2可見，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片在PMO細(xì)胞ON基因表達(dá)量均高于對照和PCL材料片上的ON基因表達(dá)量，而PCL材料片上生長的細(xì)胞ON基因表達(dá)量要低于對照組（圖2a）。在MC3T3－E1細(xì)胞的ON基因系中也有相同也出現(xiàn)了相似的趨勢（圖2b）。

圖2 nHA／PCL and PCL對PMO和MC3T3－E1細(xì)胞ON表達(dá)的影響

3.1.3 不同材料對成骨細(xì)胞OC基因表達(dá)的影響

不同材料片對成骨細(xì)胞OC基因表達(dá)的影響見圖3。經(jīng)2、6、12d，OC基因的表達(dá)變化不大。2、6、12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片上生長的成骨細(xì)胞的OC基因表達(dá)量高于對照和PCL材料片上的成骨細(xì)胞OC基因表達(dá)量。PCL材料片上生長的細(xì)胞OC基因表達(dá)量要低于或近似于對照組。

圖3 nHA／PCL and PCL對PMO和MC3T3－E1細(xì)胞OC表達(dá)的影響

3.1.4 不同材料對成骨細(xì)胞ALP基因表達(dá)的影響

不同材料對成骨細(xì)胞ALP基因表達(dá)的影響見圖4。由圖4可見，經(jīng)2、6、12d，ALP基因的表達(dá)量逐步降低。12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片上生長的細(xì)胞的ALP基因表達(dá)量比對照的ALP基因表達(dá)量要低于或近似于對照組。

圖4 nHA／PCL and PCL對PMO和MC3T3－E1細(xì)胞ALP基因表達(dá)的影響

4 結(jié)語

本文以成骨細(xì)胞樣細(xì)胞系（MC3T3－E1）和原代小鼠成骨細(xì)胞（PMO）這兩種成骨細(xì)胞作為材料研究的模式細(xì)胞，前者具有成骨細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，包括堿性磷酸酶活性、Ⅰ－型膠原合成和基質(zhì)礦化等；后者則更接近體內(nèi)細(xì)胞活性，以此對比相同材料對不同成骨細(xì)胞的影響差異。

成骨細(xì)胞在骨形成過程中經(jīng)歷分裂增殖、分化成熟和基質(zhì)鈣化3個階段［5］。其中堿性磷酸酶（ALP）是一種膜結(jié)合蛋白，可水解有機(jī)磷酸酯為基質(zhì)提供足夠的磷酸濃度使鈣鹽沉積于基質(zhì)上，它在分化早期大量表達(dá)，在骨基質(zhì)成熟過程中起重要作用，是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志。骨鈣素（OC）是由成骨細(xì)胞合成和分泌的一種非膠原蛋白，它是構(gòu)成成骨細(xì)胞胞外基質(zhì)成分之一，能維持礦化速度，抑制異常羥基磷灰石的形成。骨連蛋白（ON）能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白之間的相互作用。骨橋蛋白（OPN）廣泛分布于多種組織和細(xì)胞，是一種非膠原骨基質(zhì)糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，同時調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、遷移、增殖、分化等過程。這些蛋白在成骨細(xì)胞分化成熟和基質(zhì)鈣化過程中均有重要作用，其對應(yīng)的基因統(tǒng)稱為骨相關(guān)基因。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：nHA／PCL1、nHA／PCL2在一定程度上促進(jìn)了OC、ON、OPN的表達(dá)，而對ALP的表達(dá)有較低的抑制作用，在MC3T3－E1和PMO細(xì)胞上表現(xiàn)無差別。說明nHA／PCL復(fù)合材料具有良好的細(xì)胞相容性和促成骨細(xì)胞活性，在惰性材料中加入一定比例的HA等材料，可提高材料的生物活性，與前人研究結(jié)果［5］一致。以此材料為基礎(chǔ)，可進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)，開發(fā)出新型的具有臨床應(yīng)用前景的骨修復(fù)材料。

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