嚴婉榮， 王鐵霖， 戴良英， 楊玉文， 王建玉， 趙廷昌＊

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物安全科學技術學院，長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3.新疆兵團農(nóng)六師農(nóng)科所，五家渠 831300）

瓜類果斑病菌致病基因及靶標基因的預測

嚴婉榮1， 王鐵霖2， 戴良英1， 楊玉文2， 王建玉3， 趙廷昌2＊

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物安全科學技術學院，長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3.新疆兵團農(nóng)六師農(nóng)科所，五家渠 831300）

哈密瓜果斑病是嚴重危害瓜類的種傳細菌性病害，其病原菌為嗜酸菌屬西瓜種（Acidovoraxcitrulli）。本文首先用Bioedit軟件建立瓜類果斑病菌全氨基酸序列本地資源庫，運用比較基因組學的方法，通過大量查找嗜酸菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、勞爾氏菌屬、土壤桿菌屬、木質部小菌屬中的致病基因和參考文獻中已報道的致病基因，下載相關致病基因的氨基酸序列，與瓜類果斑病菌的全氨基酸序列進行l(wèi)ocalblast，取E＜10－5的為候選基因，得到果斑病菌中與致病性相關的基因，并對未知蛋白進行產(chǎn)物預測。同時，根據(jù)已經(jīng)公布的靶標基因，用同樣的比對方法，得到果斑病菌中潛在的靶標基因。本研究通過保守估計，得到77個致病性相關蛋白，預測了其中7個未知蛋白的產(chǎn)物，得到46個靶標蛋白。致病基因和靶標基因的分析預測，對以后研究此類基因提供了指導作用，為更好地防治該病害提供了理論基礎。

瓜類果斑病菌； 致病基因； 靶標基因

植物與病原互作的結果決定于各自所帶的基因。目前，已知的植物病原細菌的致病因子主要有胞外多糖、脂多糖、胞外酶、植物毒素和Ⅲ型效應物［1－2］。除了常見的過敏性反應和致病性基因hrp（hypersensitive reaction and pathogenicity gene）基因簇和無毒基因外，還有其他的基因與致病性相關。如在歐文氏軟腐病菌中，opgGH葡聚糖合成基因：葡聚糖（OPG）是革蘭氏陰性細菌細胞膜表面的成分，具有調節(jié)滲透壓的作用，突變時致病性喪失，胞外酶合成能力降低、胞外葡聚糖合成過剩和侵染性降低；sodA過氧化物歧化酶基因：突變體降低菌的毒性，通過轉換H2O2抵消過氧化物陰離子的作用；msrA甲硫氨酸還原酶基因：編碼還原被氧化蛋白的酶［3］；水稻條斑病菌和白葉枯病菌中，wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻條斑病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xooc）的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）合成基因，基因wxocB、wxocE和wzt與致病性有關，前兩基因的突變導致細菌完全失去毒性，而后一基因的突變導致細菌部分喪失毒性［4］。

藥物靶標是指藥物在生物體內(nèi)的作用結合位點，它可以是基因位點、受體、酶、離子通道、核酸等生物大分子?，F(xiàn)在對植物致病菌潛在靶標的研究非常少，植物致病菌的藥物靶標的個數(shù)更是少之又少。高娜等根據(jù)人類抗菌藥物靶標名稱和序列信息在16個植物致病菌基因組中進行查找，依據(jù)靶標名稱分類，在植物致病菌中共發(fā)現(xiàn)人類抗菌藥物靶標54種850個［5］。

本研究嘗試利用比較基因組的方法對植物病原細菌AcidovoraxcitrulliAAC00－1全基因組進行致病基因和靶標基因的預測分析。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

從 NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／nuccore／NC＿008752）上 獲 得AcidovoraxcitrulliAAC00－1的全基因組序列、氨基酸序列和ORFs的功能注釋等相關信息。

主要網(wǎng)絡資源：NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／），KEGG（http：∥www.genome.jp／kegg／），COG（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／sutils／coxik.cgi？gi＝20243）。

軟件：Bioedit，Excel。

1.2 預測方法

從NCBI上獲得瓜類果斑病菌全基因組的氨基酸序列，用BioEdit建立該序列的本地資源庫；

搜索大量的文獻資料，篩選出經(jīng)過驗證與細菌致病性相關的基因，查詢KEGG數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫，下載氨基酸序列。

利用生物信息學的方法，將下載到的與致病性有關的氨基酸序列與果斑病菌全基因組氨基酸序列進行l(wèi)ocalblast［6－22］，比對結果的參考標準：E＜10－5時，認為該基因和比對的基因具有同源性，分類整理這些基因，同時預測未知蛋白的產(chǎn)物。

根據(jù)已公布的靶標基因信息［23］，下載到相關靶標基因，用同樣的方法進行l(wèi)ocalblast，搜索整理獲得瓜類果斑病菌潛在靶標基因。

2 結果

2.1 致病基因

推測獲得瓜類果斑病菌基因組中致病性相關基因，并按其基因注釋的功能進行分類，結果見表1。

表1 預測致病基因分類1）

在果斑病菌中，有些基因的產(chǎn)物是未知的，通過與其他致病基因比對，在比對結果中有7個未知產(chǎn)物且有同源性的基因，并對未知產(chǎn)物進行預測，其中致病性基因的來源注釋如下，蛋白編號指果斑病菌中未知產(chǎn)物的蛋白編號，結果如表2。

表2 未知蛋白產(chǎn)物預測

2.2 靶標基因

根據(jù)已有的植物致病菌靶標信息［5］，比對預測瓜類果斑病菌基因組中潛在的靶標基因，如表3所示。

表3 潛在靶標基因信息

續(xù)表1

3 討論

比較基因組學（comparative genomics）是基于基因圖譜和測序基礎上，對已知的基因和基因組結構進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。已測序的革蘭氏陰性植物致病菌主要有以下幾類：嗜酸菌屬（Acidovorax）：瓜類細菌性果斑病菌（AcidovoraxcitrulliAAC00－1）；土壤桿菌屬（Agrobacterium）：根癌土壤桿菌 （Agrobacterium tumefaciensstr.C58）；棒形桿菌屬（Clavibacter）：番茄細菌性潰瘍病菌（Clavibactermichiganensissubsp.michiganensisNCPPB 382）；歐文氏菌屬（Erwinia）：胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwiniacarotovorasubsp.atrosepticaSCRI1043）；假單胞菌屬（Pseudomonas）：菜豆暈疫病菌（Pseudomonassyringaepv.phaseolicola1448A）、丁香假 單胞菌（Pseudomonassyringaepv.syringaeB728a）、番茄細菌性斑點病菌（Pseudomonassyringpv.tomatostr.DC3000）；青枯病菌屬（Ralstonia）：茄科勞爾氏菌（RalstoniasolanacearumGMll000）；黃單胞菌屬（Xanthomonas）：柑橘潰瘍病菌（Xanthomonasaxonopodispv.citristr.306）、白菜黑腐病菌（Xanthomonascampestrispv.campestrisstr.8004，Xanthomonascampestrispv.vesicatoriastr.ATCC 3391）、番茄瘡癡病菌（Xanthomonascampestrispv.vesicatoriastr.85－10）和水稻白葉枯病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzaeKACC10331，Xanthomonasoryzaepv.oryzaeMAFF 311018）；木質部小菌屬（Xylella）：苛養(yǎng)木桿菌（Xylellafastidiosa9a5c，XylellafastidiosaTemecula1）。這些完成測序的基因組為比較基因組分析提供了大量的材料，成為通過全基因組方法研究基因和蛋白功能的新方法。

通過保守估計，比對的結果得到了36個與Ⅲ型分泌系統(tǒng)有關的基因；3個無毒基因；11個毒性基因；10個非寄主適應性基因；2個胞外多糖基因；2個表面蛋白基因；1個細胞壁降解基因；12個其他類型的基因。但是果斑病菌中與致病性相關的基因遠遠不止這些。同時發(fā)現(xiàn)hrp基因中蛋白編號為YP＿968830的基因已經(jīng)被證實過是與致病性相關的hrcR基因［24］；根據(jù)丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonassyringaepv.tomato）DC3000中新的毒性基因tvrR（TetR－like virulence regulator）的氨基酸序列，從瓜類細菌性果斑病菌（AcidovoraxcitrulliAAC00－1）的全基因組中發(fā)現(xiàn)并克隆了tvrR基因的同源物，致病性試驗結果顯示：突變體比野生型的病程延長，但最終致病情況與野生型無差異。而在比對所得的毒性基因中也沒有發(fā)現(xiàn)與該基因有關的蛋白［25］。說明比較基因組學在預測致病性基因方面的可靠性，同時也進一步說明了本文所預測的致病性基因在很大程度上是與致病性有關的。

通過從7個植物病原細菌54個潛在的靶標基因中，預測得到了46個果斑病菌中潛在的靶標基因，從致病性基因和靶標基因的比對結果可以看到，得到的所有蛋白序列都集中在YP＿960000～YP＿970000之間，說明與果斑病菌致病性相關的基因在空間上都是在這10000個基因當中分布，就像hrp基因簇是在一個小空間成簇分布一樣，所有與致病性有關的基因是在一個相對大的空間內(nèi)分布?？梢?，靶標基因也具有一定的保守性。

果斑病作為一種較新的種傳細菌病害，其藥劑防治效果不理想，品種的抗性不強，發(fā)病范圍逐年擴大，讓我們不得不重視其潛在的危害性。植物病原細菌對寄主植物的致病過程極其復雜，一般經(jīng)過接觸、識別、侵入、定殖、擴展和發(fā)病6個階段。其中的每一步都有相應的基因參與，這些基因有的參與營養(yǎng)的獲取，有的影響信號的傳導，有的影響蛋白的分泌。在多數(shù)情況下，寄主編碼的抗病基因（R）產(chǎn)物識別有病菌編碼的無毒基因（avr）產(chǎn)物，這種互作觸發(fā)一個快速的防衛(wèi)反應，即非親和反應，病原菌被限制在初侵染位點。病菌avr基因只有在hrp基因參與的情況下才能誘發(fā)植物產(chǎn)生非親和反應。當病菌中缺少適合的avr基因或者寄主植物中缺少R基因，都將會導致親和性互作，這種情況下，病菌通過向植物分泌胞外酶、胞外多糖及其他致病因子，克服植物固有的防衛(wèi)機制，使植物發(fā)病。目前，對該病害分子機制方面的研究較少，本論文應用生物信息學的方法，保守定位致病基因和靶標基因，為以后研究致病基因的致病性和靶標基因的作用機理縮小了范圍，對以后該病害的防治和新藥的研發(fā)有一定的幫助。本文只是初步對致病基因進行了預測，對于其是否真正具有致病性還有待進一步研究。

［1］Kao C C，Barlow E，Sequeira L.Extracellar polysaccharide is required for wild－type virulence ofPseudomonassolanacearum［J］.Journal of Bacteriology，1992，174（3）：1068－1071.

［2］Federico K，Diego U F，Crisian G O，et al.Xanthomonas campestrispv.camperstrisgum mutants：effects on xanthan biosynthesis and plant virulence［J］.Journal of Bacteriology，1998，180（7）：1607－1617.

［3］賈云鶴，張俊華，崔崇士.軟腐歐文氏菌致病性的研究進展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2007，38（1）：113－117.

［4］龍菊英，張桂英，王金生.水稻條斑病菌和白葉枯病菌致病相關基因的敲除［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2006，29（2）：50－56.

［5］高娜.植物致病菌基因組重新注釋及數(shù)據(jù)庫構建［D］.淄博：山東理工大學，2009.

［6］趙文祥，韓陽春，崔一平，等.Ⅲ型分泌裝置蛋白HrcJ決定條斑病菌在植物上的過敏反應和致病性的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43（1）：72－79.

［7］蘇輝昭，向志嬌，彭方印，等.十字花科黑腐病菌中影響致病相關基因XC3814表達的基因鑒定［J］.遺傳，2010，32（1）：81－86.

［8］劉希玲，鄒華松，鄒麗芳，等.水稻白葉枯病菌hrcU基因缺失突變體構建及功能研究［J］.中國水稻科學，2010，24（4）：348－352.

［9］李玉蓉，鄒麗芳，武曉敏，等.水稻黃單胞菌avrBs3／PthA家族基因研究進展［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2007，40（10）：2193－2199.

［10］曾申艷，胡軍，黃貴修，等.水稻黃單胞菌hrp基因簇中致病相關基因hpaB的鑒定［J］.微生物學報，2007，47（3）：402－406.

［11］房保海，張廣民，遲長鳳，等.植物病原細菌hrp基因研究進展［J］.微生物學通報，2003，30（2）：102－106.

［12］龍菊英，張佳環(huán)，王金生.水稻條斑病細菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzicola）Wzt基因參與LPSO－抗原合成和影響細菌致病性［J］.自然科學進展，2005，15（10）：1195－1202.

［13］陳功友，王金生.水稻條斑病細菌hrp調節(jié)基因hrpG＿（Xooc）和hrpXooc的克隆和序列分析［J］.植物病理學報，2003，33（3）：213－219.

［14］陳功友，鄒麗芳，武曉敏，等.水稻條斑病細菌中新發(fā)現(xiàn)的avrBs3／PthA家族新成員avr／pth13基因［J］.中國水稻科學，2005，19（4）：291－296.

［15］何勇強，姚子穎，姜伯樂，等.野油菜黃單胞菌8004菌株hrp基因簇側翼序列大片段缺失突變體的構建及表型分析［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學，2005，24（3）：199－184.

［16］馬德欽，趙家英.廣宿主Ti質粒virA毒力基因對窄宿主根癌農(nóng)桿菌MI3－2菌株宿主范圍的擴展作用［J］.植物病理學報，1994，24（1）：32－34.

［17］賈云鶴，張俊華，崔崇士.軟腐歐文氏菌致病性的研究進展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2007，38（1）：113－118.

［18］楊洪江，李明春，魏東盛，等.銅綠假單胞菌pcr2基因功能的研究［J］.微生物學報，2007，47（5）：778－784.

［19］趙昕梅，馮家勛.茄青枯假單胞菌T2015致病相關基因突變體的構建［J］.信陽師范學院學報（自然科學版），2005，18（4）：413－415.

［20］張楊，張爭，徐進，等.青枯菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)編碼基因的克隆［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2008，16（1）：138－141.

［21］陳堅，林營志，劉建，等.青枯菌hrp基因的研究進展［J］.生物技術通報，2008（1）：47－51.

［22］馮莉，張玲華，田興山.青枯菌致病性與基因組之間的關系［J］.生物技術通訊，2007，18（2）：357－359.

［23］劉彬.用比較基因組的方法分析植物病原細菌致病性相關基因［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2007.

［24］任爭光，侯磊，宋治國.等.甜瓜細菌性果斑病菌致病性突變體篩選與hrcR基因的克?。跩］.植物病理學報，2009，39（5）：501－506.

［25］魏娜，錢國良，李曉霞，等.瓜類細菌性果斑病菌tvrR基因的克隆及其對致病性的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2010，33（6）：68－74.

Prediction for pathogenic genes and target genes inAcidovoraxcitrulli

Yan Wanrong1， Wang Tielin2， Dai Liangying1， Yang Yuwen2， Wang Jianyu3， Zhao Tingchang2
（1.CollegeofBio－safetyScience＆Technology，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsect Pests，InstituteofPlantProtection，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；3.InstituteofAgriculturalResearch6thBranchofXPCG，Wujiaqu831300，China）

The melon fruit blotch transmitted by seeds is a serious hazard melon bacterial disease，the pathogen of which isAcidovoraxcitrulli.This study was conducted firstly through establishing a local resource library of whole amino acid sequences of the melon fruit blotch by Bioedit software.Subsequently，the method of comparative genomics was used to search for the pathogenic genes and reference pathogenic genes previously reported inAcidovorax，Erwinia，Pseudomonas，Xanthomonas，Ralstonia，AgrobacteriumandXylellaby downloading the relevant amino acid sequences of pathogenic genes and doing local blast with the melon fruit blotch pathogen full amino acid sequence.Taking the genes withE＜10－5as the candidates，we tried to obtain pathogenesis－related genes of melon fruit blotch，and predicted the unknown protein products.Meanwhile，according to the published target genes，the potential target genes were predicted by using the similar method.By conservative estimation，77 pathogenesis－related proteins were obtained，among which7 unknown protein products were predicted.And 46 target proteins were acquired in this study.Analysis of pathogenic genes and target genes can provide a guidance for further research and a theoretical basis for preventing the disease.

melon fruit blotch； pathogenic gene； target gene

S 432.42

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.020

2011－11－15

2012－03－09

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003066）；國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS－26）

＊ 通信作者E－mail：tczhao＠ippcaas.cn