楊 帆

（銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，銅仁 554300）

銅是動物生長發(fā)育的一種必不可少的微量營養(yǎng)元素，與動物免疫機(jī)能有密切關(guān)系。但缺銅或高劑量銅都影響動物免疫器官發(fā)育。免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成。根據(jù)發(fā)生的早晚和功能的差異，可把免疫器官分為中樞免疫器官和外周免疫器官2部分，中樞免疫器官包括胸腺、骨髓及禽類的法氏囊；外周免疫器官是成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞定居、增殖和對抗原進(jìn)行免疫應(yīng)答的場所，包括淋巴結(jié)、脾臟及一些淋巴組織。許多研究表明，銅缺乏可影響免疫器官發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)維持以及正常免疫功能發(fā)揮。趙德明等對肉雞進(jìn)行了7周的低銅日糧飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)肉仔雞生長受阻，體重和主要淋巴組織器官內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，少數(shù)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的變性壞死現(xiàn)象[1]。吳建設(shè)等研究肉仔雞采食含銅量不足（≤3.03 mg/kg）的半純合日糧時，其胸腺、脾臟和法氏囊不同程度地萎縮，重量明顯低于對照組，在此日糧中分別添加銅100 mg/kg、440 mg/kg得出了同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明高銅亦可抑制肉雞免疫器官的發(fā)育[2]。楊光等用含銅650 mg／kg和850 mg／kg日糧飼喂1日齡艾維茵肉雞發(fā)現(xiàn)淋巴免疫器官體積縮小、重量減輕、淋巴細(xì)胞數(shù)量減少[3]。崔恒敏等用含銅量為850 mg／kg和1 050 mg／kg飼喂1日齡天府肉鴨發(fā)現(xiàn)免疫器官體積縮小、質(zhì)量減輕，淋巴細(xì)胞變性、壞死及數(shù)量減少[4]。目前，國內(nèi)外尚未見有不同剃度高銅日糧對雛鴨法氏囊形態(tài)影響的系統(tǒng)研究。本研究以天府肉鴨為研究對象，研究不同水平的高銅日糧對雛鴨法氏囊形態(tài)的影響，為高銅對雛鴨免疫功能影響提供理論依據(jù)。

本試驗(yàn)選用1日齡天府肉鴨，喂以梯度劑量的高銅日糧，通過觀察高銅日糧法氏囊病理形態(tài)的動態(tài)變化及其超微結(jié)構(gòu)變化，揭示高銅對雛鴨免疫功能的影響規(guī)律，從而在整體、器官組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞水平上研究探討日糧銅水平對雛鴨的病理損害，并進(jìn)一步探討發(fā)病機(jī)理，明確鴨對銅的最大耐受劑量，為基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)動物及日糧

試驗(yàn)選用1日齡天府肉鴨健雛360只，隨機(jī)分為6組，每組60只（其中15只用于全程觀察），分別采食基礎(chǔ)日糧和5種不同的高銅日糧。6組雛雞分別飼養(yǎng)于木制試驗(yàn)禽籠內(nèi)，飼養(yǎng)管理與常規(guī)育雛一致，自由飲水和采食。試驗(yàn)期6周。

基礎(chǔ)日糧以玉米、豆粕為主配制而成，其中蛋白質(zhì)含量、能量以及維生素和微量元素（銅除外）添加量均參照肉雞NRC（1994）的營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，即CP 20.12%、ME（Mcal/kg）3.0169、Ca 0.8796%、P 0.6215%、Cu 8mg/kg?；A(chǔ)日糧作為對照組日糧，在基礎(chǔ)日糧中分別添加92 mg/kg、192 mg/kg、392 mg/kg、592 mg/kg和792 mg/kg的銅構(gòu)成高銅組日糧：高銅I組（Cu 100 mg/kg）、高銅II組（Cu 200 mg/kg）、高銅Ⅲ組（Cu 400 mg/kg）、高銅Ⅳ組（Cu 600 mg/kg）、高銅Ⅴ組（Cu 800 mg/kg）。銅源為CuSO4·5H2O。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察 試驗(yàn)第1、第2、第3、第4、第5周每組隨機(jī)抽取5只剖殺，第6周雛鴨全部剖殺，觀察并記錄法氏囊肉眼變化。

1.2.2 組織學(xué)觀察 上述剖殺作尸檢的同時，取法氏囊組織以10%福爾馬林固定液固定，脫水，石蠟包埋，切片，H·E常規(guī)染色，顯微鏡下觀察并記錄其病理組織學(xué)變化。

1.2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察 試驗(yàn)結(jié)束時，每組隨機(jī)抽取3只剖殺后立即取法氏囊1～2塊，2.5%戊二醛固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鋨酸染色，在透射電鏡下觀察并記錄超微結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

試驗(yàn)第1周，各組雛鴨采食量無明顯差異。試驗(yàn)第3周，高銅Ⅲ組、高銅Ⅳ組和高銅Ⅴ組雛鴨生長發(fā)育落后于其他各組，食欲輕度下降，排泄深綠色或煤焦油樣糞便。5周齡時，高銅Ⅳ組和高銅Ⅴ組雛鴨表現(xiàn)為精神沉郁，食欲明顯下降。其他各組變化不明顯。試驗(yàn)期間高銅Ⅳ組雛鴨發(fā)病3只，高銅Ⅴ組雛鴨發(fā)病5只，但未見死亡。

2.2 法氏囊病理形態(tài)學(xué)變化

2.2.1 剖檢變化 定期剖殺雛鴨，高銅Ⅰ組、高銅Ⅱ組雛鴨法氏囊無明顯的剖檢變化，高銅Ⅲ組、高銅Ⅳ組和高銅Ⅴ組雛鴨法氏囊從3周齡開始，隨著日齡的增長表現(xiàn)出程度不同的肉眼變化。肉眼變化見法氏囊囊壁變薄，皺折減少。

2.2.2 病理組織學(xué)變化 高銅Ⅰ組、高銅Ⅱ組雛鴨法氏囊與對照組相比，無明顯的形態(tài)學(xué)改變（詳見圖1中的b～c，h～i）。高銅Ⅲ組、高銅Ⅳ組、高銅Ⅴ組法氏囊與對照組相比，出現(xiàn)程度不同的變化。病變始于3周齡，至試驗(yàn)結(jié)束時，病變逐漸明顯。高銅Ⅲ組、高銅Ⅳ組、高銅Ⅴ組法氏囊見淋巴濾泡髓質(zhì)擴(kuò)大，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。至試驗(yàn)結(jié)束時，淋巴濾泡髓質(zhì)持續(xù)擴(kuò)大，皮質(zhì)層變薄，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系（詳見圖1中的d～f，j～l）。

2.2.3 超微病理結(jié)構(gòu)變化 高銅Ⅰ組、高銅Ⅱ組與對照組相比，無明顯的形態(tài)學(xué)改變，見淋巴細(xì)胞核結(jié)構(gòu)均比較完整，雙層膜清晰可見，染色質(zhì)分布均勻，胞漿未見明顯變化。高銅Ⅲ組、高銅Ⅳ組、高銅Ⅴ組雛鴨法氏囊淋巴細(xì)胞與對應(yīng)的對照組相比，淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)量隨劑量增大而增多。見核膜擴(kuò)張（詳見圖1中的o）；凋亡淋巴細(xì)胞染色質(zhì)沿核膜凝聚呈團(tuán)塊狀（詳見圖1中m）、“C”形（詳見圖1中n）；凋亡的淋巴細(xì)胞核膜消失，呈凋亡小體（詳見圖1中q）。

3 結(jié)論與討論

病理形態(tài)學(xué)動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，銅含量超過400 mg/kg日糧飼喂的雛鴨，對雛鴨法氏囊的生長發(fā)育、組織學(xué)形態(tài)到超微病理學(xué)形態(tài)均表現(xiàn)出程度不同的病理變化。

圖1 雛鴨法氏囊病理變化

試驗(yàn)結(jié)果表明，超過機(jī)體需要量的銅不同程度地抑制了雛鴨法氏囊的生長發(fā)育，并且表現(xiàn)出一定的劑量時效關(guān)系，即隨著周齡增長，銅劑量越大對法氏囊生長發(fā)育的抑制作用越顯著。2～6周齡是對照組雛鴨持續(xù)生長并達(dá)到高峰的時期，故在這期間銅過量或銅中毒必然嚴(yán)重影響法氏囊的發(fā)育。剖解見雛鴨法氏囊囊壁變薄，皺折減少。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，高銅Ⅲ組、高銅Ⅳ組、高銅Ⅴ組雛鴨出現(xiàn)淋巴濾泡髓質(zhì)擴(kuò)大，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，皮質(zhì)變薄。法氏囊的超微結(jié)構(gòu)見凋亡小體數(shù)量增加，且伴有不同程度的核膜擴(kuò)張，線粒體腫脹、空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及淋巴細(xì)胞的壞死。

結(jié)論：日糧銅含量超過機(jī)體需要量時，不但抑制了法氏囊的生長發(fā)育，還不同程度地對法氏囊的組織結(jié)構(gòu)造成了病理損傷。

[1] 趙德明，方文軍.銅缺乏對肉雞淋巴組織器官發(fā)育的影響[J].中國獸醫(yī)科技，1996.26（6）：13-14

[2] 吳建設(shè)，咼于明，等.日糧銅水平對肉仔雞生長性能和免疫功能影響的研究.[J]畜牧獸醫(yī)學(xué)報.1999，30（5）：414-420

[3] 楊光，崔恒敏，等.實(shí)驗(yàn)性雛雞銅中毒的病理學(xué)研究.中國獸醫(yī)學(xué)報.2005，35（10）：801-806

[4] 崔恒敏，陳懷濤，等.實(shí)驗(yàn)性雛鴨銅中毒癥的病理學(xué)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2005.36（7）：715-721