姜 偉,王玉清,劉遠光,宿星杰,齊艷秀,張 劍,曹麗輝,王冬蘭

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

免疫排斥反應是引起高危角膜移植手術失敗的主要因素(發(fā)生排斥率≥60%)。雷帕霉素(Rapamycine,RAPA)作為強效免疫抑制劑已在器官移植中獲得廣泛應用,但穿透性角膜移植術后全身應用 RAPA副作用大,治療費用昂貴;而RAPA一般滴眼液難于在眼內達到有效的治療濃度[1]。因此,探索 RAPA局部用藥新劑型,對高危角膜移植術后免疫排斥反應的防治具有重要意義,為臨床治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 RAPA納米粒的制備與藥物的配制

由天津大學材料工程研究學院將 RAPA和聚乳酸/膽固醇改性殼聚糖(PLA/Cs-Chol)混合,制成 RAPA納米粒,PLA和 Cs-Chol的重量比為1:5,顆徑平均為300納米 ,以滅菌注射用水配置成0.5%RAPA納米粒滴眼液。

1.2 動物分組與滴眼

體重 2～ 3kg健康新西蘭大白兔 40只,查無眼病,隨機分為 實驗 組 與對 照組 ,每組 20只 ,分別給 藥后 15、 30、 60、 360、720min取材進行觀察。用微量取樣器給藥:對照組每眼結膜囊內單次滴0.5%RAPA滴眼液 50 μL;實驗組每眼結膜囊內單次滴0.5%RAPA納米粒滴眼液50μL。

1.3 組織樣品收集

滴眼后分別于不同時間點用帶27號針頭一次性注射器抽取房水,精密吸取100μL。將家兔耳緣靜脈注射消毒空氣處死,用0.9%氯化鈉溶液沖洗眼球后,取角膜,濾紙吸干并稱重。所有樣品以液氮速凍后儲存于-80℃低溫冰箱備用。藥物濃度采用高效液相色譜法(HPLC)測定。

1.4 樣品處理方法

取房水100μL加6%高氯酸甲醇溶液 100 μL混勻,4000r/min,離心 15min,取上清液 40μL注入液相色譜儀中 ,測定峰面積。以峰面積代入回歸曲線,求得所測試樣品濃度。角膜的處理:將角膜剪碎加重蒸水750 μL,用組織搗碎機粉碎角膜樣品,加等體積6%高氯酸甲醇溶液混勻,以下過程同房水的處理。上清液用0.45 μm的濾膜過濾,取 40 μL注入色譜儀中 ,求得樣品的量后除以角膜質量即得角膜中藥物濃度。

1.5 藥物分析方法

HPLC高效液相色譜儀為 Waters高效液相色譜儀。色譜柱為 Supelcosil LG-18DB柱 (4.6mm× 250mm,5μ m);柱溫50℃。流動相:甲醇:水=75:25;流速 1.0mL/min。檢測波長276nm,進樣體積為 20 μL,峰面積與濃度作線性回歸,對照品房水溶液配制標準曲線的濃度系列為 2、10、20、30和40ng/mL。

1.6 統(tǒng)計學分析方法

應用 SPSS10.0統(tǒng)計學軟件,用 t檢驗比較兩種滴眼液滴眼后房水及角膜中 RAPA濃度之間差異。P＜0.05有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 RAPA在兔眼房水中的濃度變化

單次給0.5%RAPA滴眼液及其納米粒滴眼液后,測量不同時間點對照組與實驗組房水中 RAPA濃度,并對房水中 RAPA濃度作 t檢驗 (表 1)。結果表明:15～ 720min時 ,兩組房水 RAPA濃度差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05),實驗組明顯高于對照組。實驗組30～ 720min各時間點房水中的藥物濃度比較無統(tǒng)計學差異 (P＞ 0.05)。

2.2 RAPA在兔眼角膜中的濃度變化

單次給0.5%RAPA滴眼液及其納米粒滴眼液后,測量不同時間點對照組與實驗組角膜中 RAPA濃度,并對角膜中 RAPA濃度作 t檢驗 (表 1)。結果表明:15～ 720min時 ,兩組角膜中 RAPA濃度差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05),實驗組明顯高于對照組。實驗組30～ 720min各時間點角膜組織中的藥物濃度比較無統(tǒng)計學差異 (P＞ 0.05)。

表1 各組兔眼用藥后不同時間點房水及角膜中的 RAPA濃度(±s,ng/mL,n=8)

表1 各組兔眼用藥后不同時間點房水及角膜中的 RAPA濃度(±s,ng/mL,n=8)

時間(min)房 水納米粒滴眼液 一般滴眼液角 膜納米粒滴眼液 一般滴眼液15 4.52± 1.32 0.00± 0.00 18.51± 5.65 5.24± 2.43 30 10.09± 0.78 0.16± 0.03 30.09± 3.03 3.83± 1.79 60 9.92± 2.07 0.18± 0.14 29.73± 4.97 1.08± 0.52 360 11.17± 1.34 0.00± 0.00 31.12± 3.07 0.00± 0.00 720 10.05± 0.79 0.00± 0.00 28.65± 2.43 0.00± 0.00

3 討論

眼病的藥物治療一直是困擾廣大眼科醫(yī)生難題,全身用藥由于“血-眼屏障”的影響,難以在眼部達到有效治療作用,且藥物在體內蓄積會引起毒副作用,治療成本高,而局部用藥是眼病治療的主要途徑。常規(guī)眼部給藥劑型由于角膜屏障和淚液稀釋難以在眼內達到理想的藥物濃度。新的藥物控釋劑型的出現(xiàn)克服了常規(guī)全身和局部用藥方式的不足,且能在眼內達到較理想且穩(wěn)定的藥物濃度,為難治性眼病(尤其是慢性眼病)的治療提供了新方法。

藥物控釋系統(tǒng)能夠將藥物在特定時間內恒速釋放作用于靶器官,并維持有效藥物濃度。Chawla[2]等人發(fā)現(xiàn)載抗腫瘤藥納米粒緩釋劑能延長藥物作用腫瘤時間,減緩腫瘤生長速度,同單純用藥相比顯著延長了腫瘤動物模型的存活時間。1970年 Yolles等率先將 PLA用作藥物長效釋放劑載體[3]。殼聚糖 (Cs)是目前研究最多的多糖類天然高分子,具有生物相容、可降解及黏膜黏滯等特性,已被用作多種醫(yī)用品[4]。而經(jīng)過膽固醇改性殼聚糖(Cs-Chol)作表面修飾材料,同時具有乳化和表面修飾作用,用做表面活性劑同 PLA載藥粒連接,可使載藥粒更好的與黏膜結合,通過載藥粒中藥物持續(xù)向外釋放,達到了向眼部持續(xù)給藥、延長藥效的作用,具有方便,無需手術的特點。實驗中0.5% RAPA納米粒滴眼液組和 RAPA一般滴眼液組前房內不同時間房水 RAPA濃度比較發(fā)現(xiàn):實驗組前房 RAPA濃度在治療期間較對照組明顯增高 (P ＜ 0.05),30、60、360,720min實驗組組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義 (P＞ 0.05)。這提示 RAPA納米粒滴眼液能向眼部有效、持續(xù)平穩(wěn)給藥。

WRIGHT等發(fā)現(xiàn),RAPA抑制混合淋巴細胞反應50%的藥物濃度為0.3μ g/L[5],因此眼部 RAPA須達到一定藥物濃度才能抑制眼部淋巴細胞的增殖和活化。姜偉等[6]發(fā)現(xiàn)應用0.5%RAPA納米粒滴眼液能顯著延長高危角膜移植術后植片存活時間。高華等[7]等發(fā)現(xiàn),當兔眼房水中 RAPA藥物濃度＞ (1.101±0.255)μg/L時,能有效抑制兔眼高危角膜移植術后免疫排斥反應和角膜新生血管生成。我們單次局部用0.5%RAPA納米粒滴眼液50μL滴眼后,兔眼房水及角膜中 RAPA濃度在 15～720min內均遠高于此水平 ,房水中RAPA濃度在 720min時為10μg/L左右,是有效治療濃度的10倍左右。在15～ 720min,RAPA納米粒滴眼液組角膜和房水中 RAPA濃度明顯高于一般滴眼液組。同 RAPA一般滴眼液相比 RAPA納米粒滴眼液能夠提供有效的藥物治療濃度,而且在較長時間內維持較高而平穩(wěn)的藥物水平,降低給藥次數(shù),從而增加患者的依從性。

[1]De Rojas Silva MV,Rodriguez Ares M T,Sanchez Salorio M,et al.Efficancy of subconjunctiv al cyclosporine containing microsperes on keratoplaty rejection in the rabbit[J].Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol,1999,237:840-847

[2]Chawla JS,Amiji MM.Biodegradable poly(caprolactone)nanoparticles for tumor-targeted delivery of tamoxifen[J].International Journal of Pharmaceutics,2002,249:127-138

[3]Yolles S,Eldridge JE,Woodland JHR.Sustained delivery of drugs from polymer/drug mixtures[J].Polymer News,1970,1(4):9-12

[4]Petri FA,Kennedy JF.Application of Chitin and Chitosan[J].Carbohydrate Polymers,1998,34(4):414-417

[5]Wright D,Deol H,Tuch B.A comparison of the sensitivity of pig and human peripheral blood mononuclear cells to the antiproliferative effedts of trational and newer immunosuppressiv e agents[J].Transpl Immunol,1999,7:141-147

[6]姜偉,孫慧敏,李筱榮,等.雷帕霉素納米粒滴眼液聯(lián)合環(huán)孢霉素A緩釋膜治療兔高危角膜移植術后免疫排斥反應的研究 [J].中華眼科雜志,2009,45(6):550-556

[7]高華,史偉云,謝立信,等.雷帕霉素緩釋片防治兔高危角膜移植免疫排斥反應和新生血管增殖的研究 [J].中華眼科雜志,2006,42(1):6-11