王麗華,王國輝,金玉玲,秦麗紅,王志群

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)一科,黑龍江 佳木斯 154003)

隨著中國老齡社會化的加快,癡呆是影響老年人生活健康的重要疾病之一[1]。近年來,細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白激酶(ex tracellular signal regulated protein kinase,ERK)通路在神經(jīng)元凋亡方面的作用引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。人參皂苷三七總皂苷是從中藥三七中提取的有效活性成分,并精制備成臨床應(yīng)用中藥三七提取物制劑,臨床應(yīng)用的機(jī)制可能有活血化瘀、通筋活絡(luò)之功效。本實驗通過三七制劑對血管性癡呆大鼠動物模型 ERK的影響,初步探討三七制劑腦保護(hù)方面的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組及給藥:Wistar雄性大鼠24只,鼠齡3～5個月,體重 300～ 350g,由佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供。動物分組及給藥:測試合格后把合格大鼠隨機(jī)分為正常對照組:不予任何處置;假手術(shù)組(除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈,余處理同模型組);模型組 (血管性癡呆大鼠動物模型 );治療組(三七制劑灌胃組);每組6只。

1.1.2 試劑:SP免疫組化試劑盒、兔抗鼠 ERK多克隆抗體、DAB顯色試劑盒,均由北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型建立:參考黃新武等[2]建立血管性癡呆大鼠動物模型。

1.2.2 制作實驗大鼠的腦組織標(biāo)本。

1.2.3 HE(蘇木精-伊紅)染色。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (± s)表 示,組間比較采用 t檢驗,檢驗水準(zhǔn)P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)觀察

手術(shù)前各組大鼠各方面活動、飲食、二便正常,毛發(fā)有光澤。制作血管性癡呆大鼠模型時,大鼠在頸總動脈結(jié)扎后出現(xiàn)短暫肢體抽搐,皮膚溫度降低,術(shù)后早期大鼠精神狀態(tài)差、少動、平衡能力差 ,隨后出現(xiàn)嗜睡、飲食差、毛發(fā)有脫落;對照組變化不明顯。模型大鼠在治療后,活動增加,攝食和飲水漸漸有所恢復(fù)。制作各組模型時死亡的大鼠除外,正常對照組6只,假手術(shù)組6只,模型組5只,治療組5只,制作模型死亡率為8.33%。

2.2 各組大鼠海馬 CA1區(qū) HE染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠海馬 HE染色觀察 CA1區(qū)錐體細(xì)胞體積完整,排列規(guī)則,胞核呈圓形或橢圓形 ,核仁顯現(xiàn)明顯,染色質(zhì)質(zhì)地均勻,細(xì)胞數(shù)量多,相比較模型組大鼠錐體細(xì)胞破碎不完整 ,壞死明顯,結(jié)構(gòu)松散,排列紊亂,細(xì)胞數(shù)量明顯減少;治療組大鼠正常細(xì)胞胞核呈圓形或橢圓形,核仁清晰,染色質(zhì)豐富,排列較密,少見固縮變性的神經(jīng)元,神經(jīng)元數(shù)量較多。

2.3 各組大鼠海馬 CA1區(qū)免疫組化海馬 ERK結(jié)果

癡呆組大鼠海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元 ERK的表達(dá)量與正常對照組和假手術(shù)組相比較,有明顯降低 (P＜0.01);治療組大鼠海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元 ERK的表達(dá)量較癡呆組升高,與正常對照組和假手術(shù)組相比較顯著降低 (P＜0.01)。

表1 各組大鼠海馬 CA1區(qū)免疫組化 ERK結(jié)果

3 討論

3.1 血管性癡呆模型的建立

相對理想的 VD模型特征有以下幾點:(1)動物選擇符合模型要求;(2)操作簡單,對動物傷害刺激小;(3)要求動物存活時間長;(4)中樞神經(jīng)元損傷明顯;(5)專家公認(rèn)的實驗大鼠行為學(xué)指標(biāo)異常。實驗解剖基礎(chǔ)源于大鼠腦部血液與人腦組成、血管分布幾乎相同,都是由基底動脈環(huán) (Willis環(huán) )進(jìn)行相互溝通,主要是指左右兩側(cè)頸內(nèi)動脈和椎-基底動脈,四血管入顱后,組成血管交通,腦內(nèi)的血液相互供應(yīng)。

國內(nèi)及國際 VD動物模型的制備盡管較多,但理想的VD模還沒有得到一個公認(rèn)。由 Pulsinelli[3]1979年首創(chuàng)四血管阻斷法(4-VO),其方法是阻斷全腦供血,對動物傷害大,動物難以存活。兩血管阻斷法 (2VO法)的經(jīng)典方法,操作簡單,手術(shù)線將頸總動脈永久性結(jié)扎,由于其操作簡單,應(yīng)用面很廣,大量研究應(yīng)用此法進(jìn)行動物模型制備,進(jìn)行相關(guān)的實驗研究[4～6],但此方法同時結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈,可能牽拉動物迷走神經(jīng),動物死亡率也偏高。黃新武[1]等在傳統(tǒng)2VO法基礎(chǔ)上采用不同時間點分別永久結(jié)扎左右頸總動脈,相隔3d間斷性永久結(jié)扎,此法操作容易,對動物傷害刺激小,動物死亡率低,并有效模擬人腦缺血的慢性過程。本實驗采用黃新武等制備模型方法不同時間點分別永久結(jié)扎左右頸總動脈即:改良2-VO。

3.2 三七制劑對血管性癡呆大鼠 ERK表達(dá)的影響

ERK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen actived protein kinase,M APK)的一個亞類,M APK是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸和 (或)蘇氨酸蛋白激酶,主要由 c-Jun氨基末端激酶 (CJun N-terminal-kinase,JN K)、 p38和 ERK 3條信 號通路組成,是細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號通路[7]。有的學(xué)者認(rèn)為 ERK的高度活化可通過調(diào)節(jié) c-fos,c-jun形成 fos-jun異源二聚體來調(diào)控下游基因,特別是凋亡相關(guān)基因的表達(dá),從而參與神經(jīng)細(xì)胞的損害過程,引起細(xì)胞凋亡。付度關(guān)[8]等試驗通過利用光化學(xué)法誘導(dǎo)建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,并在尾靜脈注射 M EK阻斷劑,實驗結(jié)果表明抑制ERK磷酸化僅能部分抑制細(xì)胞凋亡,與假手術(shù)組相比較經(jīng)阻斷劑干預(yù)的缺血組神經(jīng)元凋亡率明顯升高。而 Alessandrini等[9]在應(yīng)用另一種 M EK1特異性阻斷劑大鼠腦缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn),藥物干預(yù)組的大鼠與模型組相比梗死面積減少了大半,實驗結(jié)果認(rèn)為抑制神經(jīng)元凋亡是阻斷 ERK通路。但多數(shù)學(xué)者[10]認(rèn)為,阻斷 ERK通路激活可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,相反激活 ERK通路在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中對細(xì)胞起到保護(hù)作用。本實驗在建立可靠的 VD大鼠動物模型后,HE染色觀察假手術(shù)組大鼠海馬 CA1區(qū)錐體細(xì)胞體積完整,排列規(guī)則,胞核呈圓形或橢圓形,核仁顯現(xiàn)明顯,染色質(zhì)質(zhì)地均勻 ,細(xì)胞數(shù)量多,相比較模型組大鼠錐體細(xì)胞破碎不完整,壞死明顯,結(jié)構(gòu)松散,排列紊亂,細(xì)胞數(shù)量明顯減少。治療組可以使該區(qū)域脫失的神經(jīng)元數(shù)目明顯減少、細(xì)胞排列的更加致密且規(guī)則。免疫組織化學(xué)染色顯示:癡呆組 ERK表達(dá)量較對照組降低。ERK表達(dá)的降低可能參與血管性癡呆的發(fā)生發(fā)展過程。本實驗的結(jié)果與大多數(shù)學(xué)者的結(jié)果一致即 ERK對神經(jīng)元有保護(hù)作用。

三七制劑其主要藥理作用通過有效成分細(xì)胞內(nèi)鈣,鈉含量顯著降低 ,從而抑制鈣離子超載,達(dá)到緩解腦水腫程度,起到對缺血再灌注腦損傷保護(hù)作用;另一種機(jī)制通過非特異性的阻斷鈣通道,擴(kuò)張腦血管,增加血流量,改善腦循環(huán)作用;抗血小板凝集降低血液黏稠同時具有清除自由基及抗脂質(zhì)性氧化作用,顯著減少腦組織中及血漿中丙二醛,并顯著升高超氧化物歧化酶(SOD)活性,SOD對黃嘌呤氧化酶氧化黃嘌呤產(chǎn)生的氧自由基具有清除作用;中藥三七提取物制劑能降低腦細(xì)胞耗氧量及耗能量,達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞,起到腦保護(hù)減少缺血面積。

本實驗為進(jìn)一步研究三七制劑對血管性癡呆的治療提供了理論依據(jù)。由于本實驗研究受實驗條件限制,ERK的下游信號通過何種途徑產(chǎn)生保護(hù)作用仍需進(jìn)一步研究。

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