王克健,孫光濤,黃昕艷

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)四科,黑龍江佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯 154002)

現(xiàn)已證實 ,神經(jīng)生長因子 (Nerve Growth Factor,NGF)能夠促進 N SCs向膽堿能神經(jīng)元定向分化[1],是目前已知效應(yīng)最強的促 NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化的因子。但是其作用效果仍不理想,膽堿能神經(jīng)元分化比率仍很低。堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-1oop-helix,bHLH)是一類十分重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子家族,既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該家族在中樞神經(jīng)組織表現(xiàn)的特別明顯。按功能分為抑制型和激活型,兩者處于動態(tài)平衡狀態(tài),共同來調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化,廣泛地參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生[2]。Mashl基因則是其家族的激活型基因,在 NSCs增殖、分化的過程中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。Mash1于前腦腹側(cè)區(qū)域在膽堿能神經(jīng)元內(nèi)特異性的表達,并參與不同神經(jīng)元亞型的形成。這些現(xiàn)象提示,NGF可能通過誘導(dǎo) Mash1的表達以完成對 NSCs向膽堿能神經(jīng)元定向分化的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料

RT-PCR試劑盒購自大連寶生物;DL2000 Marker購自上海生物工程公司;低熔點瓊脂糖購自 MarescoARESCO公司;神經(jīng)干細(xì)胞為佳木斯大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 NSCs分化誘導(dǎo):取傳至第三代的 N SCs,吹打成單細(xì)胞懸液,加入含不同濃度 NGF的神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基(分別為空白對照組,NGF50mg/L組,NGF100mg/L組,NGF200mg/L組)進行分化誘導(dǎo),37℃,80%濕度,5%CO2的條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7d后提取總 RN A。

1.2.2 Mash1基因 mRN A表達的檢測:使用 RT-PCR方法檢測分化誘導(dǎo)后神經(jīng)干細(xì)胞 Mash1mRN A的含量,提取總 RNA,取 1μL RNA反轉(zhuǎn)錄制備 cDN A,然后取 1μL cDNA進行 PCR檢測。根據(jù) GenBank的 M 95603.1基因序列(小鼠Mash1的基因序列),采用 Primer-Premier5.0軟件設(shè)計出其引物,Mash1基因的上游引物序列:5’-GGA AGA TCT ATG GAG AGC TCT GGC AAG ATG-3’下游引物:5’-CCC AAG CTT GTCA GAA CCA GT T GGT AAA GTC-3’;β-actin上游引物:5’-CAT CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAAC-3’下游引物 5’-ATG GAG CCA CCG ATC CACA-3’。PCR反應(yīng)體系為:去離子水 67.5 μL;上游引物Mash1/β-actin 2 μL;下游 引物 Mash1/β -actin 2μL;Tap聚合酶 0.5 μL;10X PCR Buffer 10 μL;dN TP Mixture 8μL;模板DN A10μL;加水補足至 20μL。反應(yīng)條件:94℃ 30s;59℃ 30s;72℃ 45s,其中 Mash1重復(fù) 35個循環(huán) ,β-actin重復(fù) 18個循環(huán)。

1.2.3 電泳鑒定及其結(jié)果觀察分析:使用1%瓊脂糖凝膠電泳,穩(wěn)定電壓120毫伏 ,電泳30min。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描凝膠,測定電泳后各條帶的積分光密度值(OD),以 Mash1的 OD值與 β-actin的 OD值的比值作為 Mash1的 mRN A相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS10.0行方差分析 ,組間比較采用t檢驗。P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同實驗組提取總 RN A進行 Mash1基因的 RT-PCR反應(yīng)電泳結(jié)果顯示:各實驗組均有 Mash1表達。其中空白對照組表達最少,以 NGF100mg/L組表達量最高 (圖1)。針對Mash1與內(nèi)參積分光密度值的比值,所得數(shù)據(jù)行方差分析示:具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)(表1)。

圖1 Mash1電泳圖譜

表1 不同濃度 N GF對 Mash1表達的光密度的比較 (±s,n=3)

表1 不同濃度 N GF對 Mash1表達的光密度的比較 (±s,n=3)

單因素方差分析,與對照組比較*P ＜0.05,#P＜0.01。

組別 光密度比值對照組 30.7142± 0.0257 50mg/L組 30.7723± 0.0212*100mg/L組 30.9423± 0.0218#200mg/L組 30.8185± 0.0265#

3 討論

近年來,神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和體外分離培養(yǎng)的成功為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供了一個新的途徑、方法和手段。在神經(jīng)細(xì)胞生長過程中,N GF經(jīng)由 NGF-RAS-M APK信號通路促進細(xì)胞分裂、引導(dǎo)神經(jīng)纖維趨化性生長、誘導(dǎo)軸突生長、形成突觸網(wǎng)絡(luò)。NGF與其高親和力受體 TrkA(tyrsine kinase receptor A)結(jié)合,激活 TrkA的自身磷酸化。磷酸化的 TrkA識別 Src(Steroid receptor coactiveator)同源結(jié)構(gòu)域 2(SH2),并使其磷酸化。Shc(Src homologue and collagen protein)作為銜接蛋白(adapter protein)促使 Grb2通過自身SH3區(qū)與 GTP-GDP交換因子 Sos(Son of sevenless)結(jié)合。形成 TrkA-Shc-Grb2-Sos復(fù)合物并轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜,結(jié)合在膜內(nèi)表面的原癌基因產(chǎn)物 Ras并將其活化。其后,被活化的Ras進一步激活蘇氨酸-絲氨酸蛋白激酶 Raf,磷酸化的 Raf又使雙特異蛋白激酶 M EK磷酸化,進而激活絲裂原激活的蛋白激酶(mittogen-activated protein kinases,MAPK,又名胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶)。M APK轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核,啟動立早基因 (Immediate Early Gene,IEG)和延遲反應(yīng)基因(delayed response gene,DRG)的轉(zhuǎn)錄,對基因表達、代謝及功能進行調(diào)控。

Mash1屬于 bHLH家族中轉(zhuǎn)錄激活因子,它在染色體上定位在 12q22-q23,其由696個堿基表達的含有232個亞基的蛋白質(zhì)組成,其中包括一個含有236個氨基的能與啟動子 E-BOX(CACCTG)特異性相結(jié)合的 HLH結(jié)構(gòu)域[3]。有研究表明 Mash1的高表達僅僅局限在正在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中,Mash1在神經(jīng)的生成、神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育以及神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程中都起到巨大的正性調(diào)節(jié)作用,可以使神經(jīng)干細(xì)胞具有向神經(jīng)元方向分化的趨勢,并與同基因家族其他的正負(fù)性調(diào)節(jié)基因互相交叉共同起作用一起調(diào)節(jié)神經(jīng)組織的發(fā)生發(fā)展,從而決定了細(xì)胞的發(fā)展情況[4]。Mashl基因參與 NSCs向神經(jīng)元方向分化的啟動過程,同時也參與不同神經(jīng)細(xì)胞亞型的形成。有研究表明,Mash1的高表達與 NSCs的分化過程相統(tǒng)一,Mash1在前腦腹側(cè)區(qū)于 GABA能神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元內(nèi)特異性的表達[5]。

本實驗通過 RT-PCR技術(shù)研究 NGF對神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)Mash1表達的影響,電泳結(jié)果顯示:NGF能夠促進 NSCs內(nèi)Mash1基因的表達并提示 NGF促進 NSCs向膽堿能神經(jīng)元定向分化的潛在機制可能是通過促進 Mash1的表達而完成的。但是在 N GF信號通路里 ,Mash1具體扮演何種角色仍不清楚,Mash1確切的下游基因尚不確定,其下游復(fù)雜的基因環(huán)路有待我們進一步研究。

[1]劉佳梅,陳東,孟曉婷.神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元的分化 [J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2005,21(6):603-606

[2]Bang AG,Goulding MD.Regulation of v ertebrate neural cell fate by trnasption factors[J].Curr Opin Neurobiol,1996,6(1):25-32

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