劉東璞,盧鳳美,姚海濤,孟慶媛,盛延良,尹興忠,王 抒

(佳木斯大學(xué)司法鑒定中心,黑龍江 佳木斯 154007)

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)發(fā)病率位居全身惡性腫瘤第五,其死亡率列第三位,對人們的身體健康構(gòu)成嚴(yán)重影響。目前公認(rèn)乙型肝炎病毒(HBV)和黃曲霉毒素 B1(Aflatoxin B1,AFB1)與肝癌發(fā)生關(guān)系密切,其中AFB1已被世界衛(wèi)生組織確定為人類第一類己知致癌物,是人類谷物和動(dòng)物飼料中最常見得真菌毒素。本實(shí)驗(yàn)旨在建立AFB1誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只健康雄性 SD大鼠,體重180～220g,由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將 40只 SD大鼠隨機(jī)將其分為兩組:(1)AFB1組(25只),于第三周開始腹腔注射 AFB1:第3～16W:200μ g/kg體重 ,3次 /W;第 22～ 30W:100 μg/kg體重 ,2次 /W;第 35～45W:100 μg/kg,1次 /W。

(2)對照組 (15只),于第一周開始飼食正常飼料直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。不給 AFB1處理。

分別于實(shí)驗(yàn)第18W、32W、55W于大鼠大腿內(nèi)側(cè)近腹股溝處經(jīng)股靜脈穿刺抽血約1.5mL,離心后留取血清標(biāo)本于-40℃冰箱保存。

第60W斷頸處死全部大鼠,解剖大鼠常規(guī)留取有腫塊的肝組織及數(shù)塊腫塊旁肝組織,所取肝組織切取一部分放入10%中性福爾馬林溶液內(nèi)固定24h后常規(guī)石蠟包埋,用于HE染色及免疫組織化學(xué)染色;剩余部分立即投入液氮速凍后再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。血清按照試劑說明書以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測 AFP水平。

2 結(jié)果

2.1 肝癌模型的成功率

實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第 60W)時(shí) ,AFB1組有效動(dòng)物數(shù)為25只,20只發(fā)生惡性腫瘤 ,其中2只為膽管上皮細(xì)胞癌,其余為肝細(xì)胞肝癌 (HCC);PHC發(fā)生率為80%(20/25)。對照組 15只,無腫瘤發(fā)生。

2.2 肝癌發(fā)生過程中大鼠血清 AFP的變化

酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)檢測大鼠血清 AFP水平,隨著模型組 AFB1誘導(dǎo)周數(shù)的增加肝臟體積增大,肝細(xì)胞彌漫性脂肪變,血清 AFP明顯升高 (P＜0.05)。對照組大鼠AFP水平無明顯變化。詳見表1。

表1 肝癌發(fā)生過程中大鼠血清 AFP的變化 (±s,ng/mL)

表1 肝癌發(fā)生過程中大鼠血清 AFP的變化 (±s,ng/mL)

與正常組相比aP＜0.05;模型組之間相比bP＜0.05。

分組/只 18周 32周 55周AFB1(25) 120.63± 5.34a、b 242.63± 5.64a、 b 420.63± 6.34a對照組(15) 81.63±5.41 120.63± 5.34 240.63±5.26

2.3 病理組織學(xué)觀察

2.3.1 大體觀察

大體觀察肝臟表面腫塊散在分布,呈結(jié)節(jié)隆起狀;巨塊型一例伴肝硬化;另有腫塊呈明顯的菜花狀,腫塊中心有壞死。對照組大鼠肝臟表面較光滑,質(zhì)地柔軟。

2.3.2 光鏡觀察

組織學(xué)觀察癌細(xì)胞呈不規(guī)則形,以中、低分化為主。癌細(xì)胞體積明顯增大,胞漿呈弱嗜堿性,核 /漿比例增大 ,細(xì)胞核染色加深,形狀不規(guī)則。另外 AFB1組還有2例膽管上皮細(xì)胞癌和2例肝癌腎轉(zhuǎn)移。肝門管區(qū)常可見到纖維結(jié)締組織增生及炎細(xì)胞浸潤,非腫瘤肝組織內(nèi)可見小葉結(jié)構(gòu)清楚完整,肝細(xì)胞增生灶、增生結(jié)節(jié)或部分肝細(xì)胞排列成雙行、多行甚至成小片狀。

對照組肝索圍繞小葉中央靜脈呈放射狀排列,肝細(xì)胞排列整齊,核大小一致,分布均勻 ,肝竇清晰,肝細(xì)胞無明顯增生改變。

3 討論

建立肝癌動(dòng)物模型是進(jìn)行肝癌實(shí)驗(yàn)研究的重要平臺和手段。目前建立肝癌模型的方法較多,可分為種植性、誘發(fā)性、自發(fā)性及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物肝癌模型等。誘發(fā)性肝癌模型是進(jìn)行腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的常用方法,它采用物理、化學(xué)、生物等致癌因素在實(shí)驗(yàn)條件下誘發(fā)動(dòng)物發(fā)生肝癌。其中 AFBl誘發(fā)肝癌模型是目前應(yīng)用最為廣泛的一種方法[1～7]。真菌毒素AFB1常見于人類食物和動(dòng)物飼料中,具有很強(qiáng)的肝毒性和遺傳毒性,因此被列為人類的致癌物。

本實(shí)驗(yàn) AFB1腹腔注射劑量的選擇是在前期多次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上的動(dòng)態(tài)調(diào)整。歷時(shí)一年余建模成功,實(shí)驗(yàn)組惡性腫瘤發(fā)生率為80%,而對照組無腫瘤發(fā)生,上述結(jié)果表明大鼠肝癌為 AFBl所誘發(fā),而非“自發(fā)性”腫瘤。因此本實(shí)驗(yàn)肝癌模型的建立是成功的。雖然本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用小劑量 AFB1誘癌時(shí)間較長,但符合實(shí)際暴露于 AFB1的人群是長期低水平攝入的情況,因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)很好的模擬人群的實(shí)際情況。AFB1誘發(fā)的肝癌與自然發(fā)生的人類肝癌相似,腫瘤多為單發(fā)性,腫瘤細(xì)胞的組織形態(tài)與人的肝癌細(xì)胞相似,其中 HCC比例高。綜上所述該方法比較成熟,建立的模型較穩(wěn)定,對于實(shí)驗(yàn)觀察和分析藥物對肝癌的干預(yù)作用是較為理想的動(dòng)物模型。

血清 AFP水平是最常用診斷肝癌實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。20世紀(jì)60年代 Kores[8]最早報(bào)道了在 AFB1誘發(fā)大鼠 PHC的過程中伴有血清 AFP濃度的升高 ,本實(shí)驗(yàn)由18～55W,三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清 AFP均增高,其中 AFB1組最顯著。對照組 AFP水平升高 ,但 ＜300ng/mL,考慮可能與階段性肝活檢有關(guān),反復(fù)的活檢致使肝損傷造成肝細(xì)胞增殖。有研究報(bào)道在慢性肝臟疾病中血清 AFP增高,范圍21～ 225ng/mL區(qū)間,一般不超過400ng/mL[9],本研究與此相符。實(shí)驗(yàn)的第 32W和55W,AFB1組血清 AFP的水平均顯著高于對照組。

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