張秋月,陳國萍,韓 鋼,米 延,李 麗

(1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院新生兒科,黑龍江 哈爾濱 150001;2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是新生兒常見疾病之一,也是導(dǎo)致新生兒死亡或留有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的主要原因之一。因此尋找安全、有效地治療方法一直是國內(nèi)外研究的熱點。已有研究證明氧自由基與缺氧缺血性腦損傷密切相關(guān),近年來許多國內(nèi)外文獻報道促紅細胞生成素(EPO)不僅具有促進造血祖細胞增殖分化的作用,而且對缺氧缺血性腦損傷大腦具有神經(jīng)保護作用[1]。本實驗在建立新生大鼠 HIBD模型的基礎(chǔ)上 ,外源性給予 EPO進行干預(yù)治療 ,以脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物丙二醛(MDA)水平及神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)作為觀察指標,旨在對 EPO治療 HIBD的作用機制進行探討并為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:選用健康7日齡 Wistar大鼠54只 ,體重11～15g,雌雄不分,由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.1.2 主要藥品和試劑:促紅細胞生成素注射液,沈陽三生制藥股份有限公司生產(chǎn)。BCA蛋白濃度測定試劑盒、脂質(zhì)氧化 (M DA)檢測試劑盒、IP細胞裂解液、TUN EL細胞凋亡檢測試劑盒,以上均為碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 缺氧缺血動物模型制備:將大鼠乙醚麻醉后,做頸正中切口,分離右側(cè)頸總動脈后用絲線結(jié)扎,縫合皮膚,術(shù)后恢復(fù)2h,然后置于37℃水浴且通入8%氧氣和92%氮氣的混合氣體的密閉缺氧箱中缺氧 2h[2]。

1.2.2 動物分組及處理:實驗動物隨機分為假手術(shù)組、生理鹽水對照組和 EPO治療組。每組各18只。假手術(shù)組只分離右側(cè)頸總動脈,不結(jié)扎、不缺氧,亦不給予藥物干預(yù);EPO治療組在制成模型后每天腹腔注射 EPO 5 000U/kg;生理鹽水對照組制成模型后每天腹腔注射同體積生理鹽水;上述動物均回籠飼養(yǎng),24h、48h、72h后斷頭處死每組取6只,取右側(cè)大腦半球。

1.2.3 檢測方法:取樣本組織加入細胞裂解液,制作組織勻漿,離心后取上清測定。MDA測定采用硫代巴比妥比色法。細胞凋亡檢測采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位末端標記法,胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞,高倍鏡下著缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)隨機選取10個視野,計數(shù) 500個細胞,計算陽性率即凋亡指數(shù)(AI)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

各組動物腦組織 M DA水平比較見表1。鹽水對照組較假手術(shù)組 MDA水平增高有顯著性差異,EPO治療組較鹽水對照組 MDA水平降低有顯著性差異。

表1 各組腦組織 MDA含量(±s,nmol/mg)

表1 各組腦組織 MDA含量(±s,nmol/mg)

△與假手術(shù)組比較 P＜0.05;*與鹽水對照組比較 P＜0.05。

組別 24h 48h 72h假手術(shù)組 8.711± 0.29 9.687± 0.46 9.782± 0.56鹽水對照組 14.639± 0.54△ 20.539± 1.19△ 23.237± 0.54△EPO治療組 10.267± 1.00* 10.502± 0.46* 11.685± 0.74*

各組動物神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)比較見表2。鹽水對照組較假手術(shù)組 AI水平增高有顯著性差異,EPO治療組較鹽水對照組 AI水平降低有顯著性差異。

表2 各組動物 AI的變化 (±s,%)

表2 各組動物 AI的變化 (±s,%)

△與假手術(shù)組比較 P＜0.05;*與鹽水對照組比較 P＜0.05。

組別 24h 48h 72h假手術(shù)組 7.2± 1.3 2.2± 0.8 1.8±1.1鹽水對照組 14.8± 3.7△ 19.4± 2.6△ 15.8± 4.2△EPO治療組 8.7± 1.5* 10.2± 1.8* 10.3± 2.9*

3 討論

EPO是一種含唾液酸的酸性糖蛋白,能促進造血祖細胞的增殖分化。EPO在體內(nèi)不能儲存,主要由血氧含量的變化經(jīng)缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF—1)路徑來調(diào)節(jié)其生成。EPO通過EPO受體(EPO-R)發(fā)揮生物學效應(yīng)[3]。目前許多臨床及實驗研究都顯示 EPO不僅影響造血系統(tǒng),而且在應(yīng)激時發(fā)揮重要的保護機體的作用,對整個生物體發(fā)揮廣泛的組織保護效應(yīng)[4],其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)細胞、星形膠質(zhì)細胞可通過旁分泌或自分泌方式分泌 EPO,并與附近神經(jīng)元細胞膜上的 EPO-R結(jié)合。在動物實驗中,Kumral等[5]證實新生幼鼠腦缺氧缺血后立即給予 EPO治療,通過 Morris水迷宮測試,長期神經(jīng)行為能力明顯改善。Dzietko等[6]體內(nèi)實驗證實EPO可減少神經(jīng)元由于缺氧缺血所造成的死亡,其機制是減少經(jīng) NMDA受體調(diào)節(jié)的興奮性氨基酸神經(jīng)毒性作用。曾志等[7]發(fā)現(xiàn)早期運用外源的 EPO可明顯減輕 HIBD大鼠的腦組織損傷程度,保障其腦功能的相對正常。

Calacpai等[8]報道,在大腦缺血后立即腹腔給予重組促紅細胞生成素可對丙二醛水平增加、大腦水腫、遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡及一氧化氮的過度生成有改善的作用。本研究發(fā)現(xiàn)鹽水對照組(即 HIBD組 )較假手術(shù)組(正常組)MDA含量及 AI明顯增高,外源性應(yīng)用 EPO干預(yù)后 HIBD腦組織中 MDA含量及 AI明顯降低,與文獻一致。MDA為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,其水平反映機體細胞氧化損傷的程度。說明可能是缺氧缺血后再灌注導(dǎo)致腦組織產(chǎn)生大量氧自由基,脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強,導(dǎo)致 M DA增高。EPO治療后使 M DA降低可能是通過增加超氧化物歧化酶的活性來減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生;AI降低機制則可能包括減少 NO過度生成、抑制谷氨酸受體介導(dǎo)的毒性作用及直接增加抗凋亡基因的表達等。

綜上所述,EPO可通過抑制丙二醛的增加和神經(jīng)細胞凋亡來發(fā)揮缺氧缺血性腦損傷的保護作用。EPO將為新生兒HIE的治療提供一個新的途徑。

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