張曉娟，李旭，欒正剛，馬曉春

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110001）

膿毒癥是指由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，其發(fā)生率以每年1.5%～8%的速度遞增［1］。高遷移率族蛋白 1（high mobility group box 1，HMGB1）是高遷移率族蛋白超家族成員之一，是廣泛存在于真核細(xì)胞核中最重要的非組蛋白，分子質(zhì)量小，含量豐富，序列高度保守［2，3］。HMGB1 是膿毒血癥晚期重要的炎性介質(zhì)［4］。血管內(nèi)皮細(xì)胞在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，當(dāng)其受到炎性刺激時(shí)可釋放HMGB1，促進(jìn)細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)［5，6］。HMGB1激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的分子機(jī)制尚未明確。本研究旨在構(gòu)建HMGB1基因真核細(xì)胞表達(dá)載體，并鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中后HMGB1蛋白的表達(dá)，為HMGB1基因在膿毒癥發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞信號(hào)的研究提供有利的分子工具。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical venular endothelial cell，HUVEC）株購(gòu)自南京凱基生物公司，PCDNA-3.1-myc-his-B質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

High-glucose DMEM、胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司；KpnⅠ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶﹑T4 ligase DNA連接酶﹑氨芐青霉素100 mg/mL﹑瓊脂糖凝膠﹑DL2000 DNA Marker﹑HindⅢ-digest DNA Marker﹑RT-PCR 試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；兔抗His標(biāo)簽抗體購(gòu)自Santa Cruze公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自中杉公司，小提質(zhì)粒試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自于愛(ài)思進(jìn)公司。引物合成、DNA測(cè)序鑒定由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)HUVEC至90%融合，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增HMGB1的可讀框。用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游和下游分別引入KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列如下：上游：5′-GGGGTACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAGA-3′；下游 ：5′-CGGAATTCGTTTCATCATCATCATCTTCTTC-3′。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72℃50 s，循環(huán)30次。擴(kuò)增長(zhǎng)度為647 bp，將PCR產(chǎn)物和PCDNA-3.1-myc-his-B用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切，電泳后切膠回收。T4連接酶16℃連接16 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，以含氨芐青霉素的LB選擇性固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，然后測(cè)序。

1.2.2 提取無(wú)內(nèi)毒素重組載體：將酶切陽(yáng)性且測(cè)序結(jié)果吻合的菌液接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌液，采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)抽提無(wú)內(nèi)毒素重組體。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：收獲處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，以 5×104/孔接種于 6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合，按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染PCDNA-3.1-myc-his-B空載體）和實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染48 h后收集RNA和蛋白進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。

1.2.4 Western blot：PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC 48 h后，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總蛋白，考馬斯亮蘭定量，將樣品調(diào)成相同的濃度，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水煮5 min，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，將膜與一抗（兔抗His標(biāo)簽抗體1︰500稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h，PBST洗膜，將膜與ECL發(fā)光底物結(jié)合，曝光，顯影。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖電泳結(jié)果

1%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，PCR反應(yīng)產(chǎn)物大小為647 bp，與GenBank中登錄的人HMGB1基因大小一致。見(jiàn)圖1。

2.2 PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒的的雙酶切鑒定

提取PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒，經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切，電泳結(jié)果如圖2所示，重組質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生5 500 bp與647 bp 2個(gè)條帶，分別與PCDNA-3.1-myc-his-B和HMGB1基因大小相符，初步確定PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果分析

提取PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒，經(jīng)上海生工生物公司測(cè)序，結(jié)果與GenBank中HMGB1序列比對(duì)，完全一致，無(wú)移碼，無(wú)突變，確定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 蛋白水平檢測(cè)PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒在HUVEC中的表達(dá)

PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC 48 h后，提取細(xì)胞總蛋白做Western blot檢測(cè)，與PCDNA-3.1-myc-his-B空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比，外源重組蛋白HMGB1在PCDNA-3.1-myc-his-BHMGB1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HUVEC內(nèi)有表達(dá)。見(jiàn)圖3。

3 討論

HMGB1是一種普遍存在的核蛋白，廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，在胸腺、淋巴組織、睪丸和新生兒肝臟中均可檢測(cè)到高水平的HMGB1［7］。不同存在部位的HMGB1可發(fā)揮不同的生物學(xué)功能及效應(yīng)：細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1為DNA結(jié)合蛋白，能維持核小體結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及類(lèi)固醇類(lèi)激素受體的活性；胞外HMGB1為一種重要的炎性介質(zhì)和致炎細(xì)胞因子，是啟動(dòng)和維持炎癥瀑式反應(yīng)的中心分子，與膿毒癥的發(fā)病機(jī)理關(guān)系密切［8］。胞外HMGB1需要與相應(yīng)胞膜受體結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）與HMGB1具有高親和力，是HMGB1的主要受體［9］，HMGB1與RAGE結(jié)合后，可引發(fā)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）的磷酸化（包括 p38MAPK、JNK1/2、ERK1/2），核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 和活化蛋白 1的核內(nèi)轉(zhuǎn)移，使其他炎性因子如IL-1β、TNF-α及IL-8等表達(dá)加強(qiáng)，釋放增多，從而啟動(dòng)炎癥或使炎癥惡化［10］。膿毒癥時(shí)，RAGE在內(nèi)皮中廣泛表達(dá)，提示HMGB1可能對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有激活作用，并且促成了對(duì)感染的炎性反應(yīng)。然而，RAGE不應(yīng)是HMGB1的唯一受體，近期研究結(jié)果顯示，Toll樣受體 2（toll like receptor 2，TLR2）和 4（TLR4）可能也作為HMGB1的受體參與HMGB1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］。前期的研究證實(shí)，HMGB1可由激活的內(nèi)皮細(xì)胞釋放，促進(jìn)細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)增加。內(nèi)皮可能是HMGB1分泌的重要源泉［12］。本研究應(yīng)用PCR方法從HUVEC中擴(kuò)增HMGB1全長(zhǎng)基因，酶切后定向克隆到帶有HIS標(biāo)簽的真核細(xì)胞表達(dá)載體PcDNA3.1中，酶切測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功；再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HUVEC中，Western blot檢測(cè)到HMGB1在HUVEC中與轉(zhuǎn)染空載體組對(duì)比呈高表達(dá)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索HMGB1在膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或激活中的作用提供了一種新的研究工具。

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