張 棟，魏臻武，武自念，屠德鵬，李偉民

（1．揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 揚州225009；2．農(nóng)業(yè)部全國草業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，北京100125）

淮陰苜蓿（Medicago sativa Huaiyin）是我國江淮地區(qū)已登記的地方品種，迄今已有200多年栽培歷史，經(jīng)過多年栽培馴化已形成一個能適應(yīng)江淮流域的地方苜蓿品種［1］?；搓庈俎Ｒ蚱渖L發(fā)育快、再生性好、干物質(zhì)產(chǎn)量高、越夏率高而成為江淮流域優(yōu)良苜蓿地方品種。近年來，隨著江淮地區(qū)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，苜蓿需求量增大，但適應(yīng)江淮地區(qū)的苜蓿資源有限，難以滿足需求。

分子標記技術(shù)的發(fā)展帶動了DNA指紋圖譜技術(shù)的快速發(fā)展，使其在農(nóng)作物品種鑒定、種子純度檢測和品種親緣關(guān)系等方面得到大量應(yīng)用。SSR標記作為第二代分子標記相對于其他分子標記具有檢測快捷、簡便、穩(wěn)定的特點，并且覆蓋整個基因組，呈現(xiàn)多基因、共顯性遺傳［2－5］，已被廣泛用于玉米（Zea mays）［6］、大豆（Glycine max）［7］、水稻（Oryza sativa）［8］、小麥（Triticum aestivum）［9］等作物的指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析。SSR標記在苜蓿遺傳多樣性分析、遺傳結(jié)構(gòu)分析、指紋圖譜的構(gòu)建等研究中也得到了廣泛應(yīng)用［10－12］。群體的取樣策略是影響遺傳多樣性分析與構(gòu)建SSR指紋圖譜的關(guān)鍵因素，楊曉莉等［13］采用單株取樣（每品種10個單株）策略，發(fā)現(xiàn)利用隨機擴增多態(tài)性DNA標記（Random Amplifield Polymorphic DNA，RAPD）分子標記難以區(qū)分甘肅苜蓿品種（群）。鑒于此，進一步研究確定苜蓿遺傳多樣性分析的取樣數(shù)量，對利用分子標記進行苜蓿遺傳多樣性分析、品種鑒定及指紋圖譜的構(gòu)建等具有理論價值和實際指導(dǎo)意義。

本研究采用不同的取樣策略，利用SSR分子標記研究淮陰苜蓿遺傳多樣性，確定最佳取樣數(shù)，在此基礎(chǔ)上利用篩選的SSR引物構(gòu)建淮陰苜蓿的指紋圖譜，并采用15份供試紫花苜蓿材料進行檢測，以實現(xiàn)對淮陰苜蓿品種的鑒定，為后續(xù)開發(fā)利用淮陰苜蓿提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 試驗材料為地方紫花苜蓿品種——淮陰苜蓿及國內(nèi)外育成的紫花苜蓿品種（表1）。

試驗材料淮陰苜蓿種子由全國畜牧總站種質(zhì)資源中期庫提供，共計384粒種子。于2010年10月用育苗盤進行育苗，7d后移栽至揚州大學(xué)草業(yè)科學(xué)試驗基地；其余15份材料采用3行條播，行距0．7m。

1．2 試驗方法

1．2．1 DNA的提取 采用改良CTAB法［14］對320株淮陰苜蓿單株基因組DNA進行提取，對于其余15份供試苜蓿材料，每份材料每株采取1～2片鮮葉，共隨機采取60株的葉片混合，采用同樣的方法提取基因組DNA，用0．8%瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計分別對其質(zhì)量和濃度進行檢測，提取的DNA溶解于100μL TE后放入4℃冰箱備用。

表1 試驗苜蓿品種及來源Table 1 Alfalfa varieties list and source in this study

1．2．2 DNA混合樣的制備 DNA混合樣設(shè)置A、B、C、D、E、F 6個處理，每個處理設(shè)置8個重復(fù)，6個處理分別為10、20、30、40、50、60株淮陰苜蓿單株DNA隨機等量混合。

1．2．3 SSR擴增反應(yīng)體系與凝膠電泳及銀染 反應(yīng)體系為10μL（每孔添加量）：PCR體系含0．24μL dNTP（10μmol·L－1），3μL Primer（10μmol·μL－1），0．16μL Tap polymerase（1U），1．5μL 10×buffer（1 μmol·L－1），3μL DNA模板（20～90ng·μL－1），0．9 μL Mg2＋（20mmol·L－1），1．2μL ddH2O。

PCR擴增程序：94℃預(yù)變性3min，95℃變性1min，55℃退火1．5min，72℃延伸1min，共循環(huán)35次，最后72℃保溫8min，4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物中加入1μL溴酚藍緩沖液（Loading buffer），擴增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）檢測，恒壓180V，電泳1．5h，銀染觀察并照相保存。

1．2．4 引物來源 選用130對蒺藜苜蓿（M．truncatula）SSR 引 物［14－15］，由 上 海 生 物 工 程 有 限 公 司 合成。

1．2．5 譜帶記錄及數(shù)據(jù)分析 SSR擴增譜帶采用Quantity one統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，引物擴增片段按分子量大小排列，記錄易于辨認的多態(tài)性位點，有帶記為1，無帶記為0，建立0、1統(tǒng)計表。

式中，i為基因型，Pi為某一基因型在群體中出現(xiàn)的頻率。

用SPSS 19．0對不同處理的Stoddart指數(shù)和Simpson指數(shù)進行SNK顯著性檢驗，用于分析不同處理的遺傳差異并進行比較。

2 結(jié)果與分析

2．1 SSR引物的篩選 選用平均分布在蒺藜苜蓿8條染色體上的130對SSR引物，對淮陰苜蓿及其余15份苜蓿材料進行多態(tài)性分析，選取擴增條帶好、條帶差異明顯、重復(fù)性好、信號強、背景清晰的7對引物（表2），這7對引物分別分布于蒺藜苜蓿4號連鎖群、1號連鎖群、3號連鎖群、2號連鎖群、8號連鎖群、7號連鎖群和5號連鎖群。在淮陰苜蓿及其余15份苜蓿材料共檢測出41個多態(tài)性條帶，每對引物檢測到4～9個數(shù)目不等的多態(tài)性條帶，平均為5．86個，片段大小為80～560bp。

表2 苜蓿DNA中SSR檢測的等位基因Table 2 Alleles of alfalfa DNA decteted by SSR

2．2 取樣策略分析 選用篩選的前4對SSR引物對淮陰苜蓿DNA混合樣的6個處理進行擴增、電泳（圖1，圖2），根據(jù)SSR標記數(shù)據(jù)計算各個處理遺傳參數(shù)Stoddart指數(shù)和Simpson指數(shù)。處理A、B、C、D、E、F的Stoddart指數(shù)分別為22．36、13．49、7．78、5．28、4．42、4．00；Simpson指數(shù)分別為0．95、0．92、0．86、0．77、0．75、0．73。Stoddart指數(shù)：其中B與C之間差異不顯著；C、D、E、F之間差異不顯著（P＞0．05）；A與B、C、D、E、F之間差異顯著（P＜0．05）；B與D、E、F之間差異顯著。Simpson指數(shù)：其中A、B之間無顯著差異；D、E、F之間無顯著差異；A、B與D、E、F之間差異顯著；C與 A、B、D、E、F之間差異顯著（表3）。隨著淮陰苜蓿取樣數(shù)的增大，遺傳多樣性指數(shù)變化幅度逐漸減小，說明取樣數(shù)越大越能代表淮陰苜蓿群體，取樣數(shù)為40、50、60時，Stoddart指數(shù)、Simpson指數(shù)差異都不顯著，但從實驗工作量方面考慮，40株是最佳取樣策略。

2．3 淮陰苜蓿的鑒定及SSR指紋圖譜的構(gòu)建

試驗選用 MTB 3、MTB 13和 MTB 153三個篩選出的多態(tài)性好的引物用于淮陰苜蓿的鑒定及SSR指紋圖譜的構(gòu)建。引物 MTB 3、MTB 13和MTB 153檢測出清晰的條帶和多態(tài)性帶數(shù)分別為6和3個、5和3個、6和3個，結(jié)果表明，單一的引物均不能區(qū)分淮陰苜蓿與其余15份苜蓿品種。為了提高鑒別能力，先用引物 MTB 3、MTB 13和 MTB 153分別對淮陰苜蓿及15份供試材料進行擴增，再將每種材料的3種擴增產(chǎn)物分別等量混合［18］，然后對淮陰苜蓿品種進行鑒定，發(fā)現(xiàn)可以明確地對淮陰苜蓿進行區(qū)分（圖3）。因此，這3對SSR引物可以應(yīng)用于淮陰苜蓿的鑒定。

圖1 引物MTB 81在淮陰苜蓿10～30株單株DNA混合體系的電泳圖Fig．1 Electrophoretogram of 10－30individual plant DNA mixture system by primer MTB81

圖2 引物MTB 81在淮陰苜蓿40～60株單株DNA混合體系電泳圖Fig．2 Electrophoretogram of 40－60individual plant DNA mixture by primer MTB81

表3 不同處理群遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity index of different treatments

圖3 淮陰苜蓿鑒定電泳圖Fig．1 Indentification electrophoretogram of Huaiyin alfalfa

3 討論

3．1 淮陰苜蓿取樣策略分析 樣本大小的確定可以為苜蓿群體分化和遺傳多樣性分析提供更加可靠的 數(shù) 據(jù) 信 息。Herrmann 等［19］、Sardaro等［20］和Kolliker等［21］分別在紅三葉（Trifolium pratense）、百脈根（Lotus cornioulatus）與黑麥草（Lolium perenne）的遺傳多樣性研究中發(fā)現(xiàn)40、10和30株是合理的取樣策略。在苜蓿上，Jenczewski等［22］利用RAPD標記分析不同紫花苜蓿品種的遺傳分化采用樣本大小為20株。班霆等［23］發(fā)現(xiàn)，取樣策略為20株與40和60株的DNA混合樣聚類分析結(jié)果不一樣。以上研究表明，取樣策略的不同會導(dǎo)致物種遺傳多樣性的顯著差異，取樣量過小難以保證研究結(jié)果的可靠性，取樣量過大又會造成大量的人力資源浪費。因此，在研究不同物種的遺傳多樣性前，應(yīng)首先進行取樣策略的研究。Labombarda等［24］與Doris等［25］在研究紫花苜蓿的遺傳多樣性時認為，40株是一個最佳取樣策略，但他們僅分析了10、20、40和60取樣數(shù)之間的差異。為進一步確定最佳的取樣策略，本研究深入分析了30、40和50株之間的差異，結(jié)果表明，30株不能代表整個群體，也得出40株是最佳的取樣策略；造成遺傳多樣性分析過程中取樣策略的差異可能是由紫花苜蓿的異花授粉和四倍體特性所引起的，取樣量太小對苜蓿群體而言不具有代表性，隨著取樣量的增加，對苜蓿種質(zhì)的遺傳多樣性的分析更加準確。

3．2 SSR指紋圖譜的構(gòu)建 SSR分子標記技術(shù)是從DNA分子水平檢測基因組的遺傳位點，基因組DNA序列不同，就能產(chǎn)生不同的指紋圖譜。在粳稻的研究中發(fā)現(xiàn)利用15個多態(tài)性SSR就可以區(qū)分59個日本粳稻育成品種［26］。在大麥（Hordeum sativum）中利用4對SSR引物組成的3個不同組合可區(qū)分24個大麥品種，錯誤率為千分之一［27］。同時SSR標記技術(shù)也被廣泛用于苜蓿的遺傳多樣性分析［28］和指紋圖譜的構(gòu)建［12］。本研究利用SSR標記技術(shù)對構(gòu)建淮陰苜蓿品種指紋圖譜進行了探討，發(fā)現(xiàn)利用單一的引物不能很好地把淮陰苜蓿與其他苜蓿材料區(qū)分開，這與魏臻武［12］利用SSR、ISSR和RAPD技術(shù)構(gòu)建苜?；蚪MDNA指紋圖譜的試驗結(jié)果一致。本試驗從130對引物中篩選擴增帶型穩(wěn)定、多態(tài)性強、重復(fù)好的3對引物，根據(jù)概率論的數(shù)理統(tǒng)計原理［29］，計算出在9個位點上出現(xiàn)完全相同的概率為1．95×10－3。因此，在全國苜蓿品種中出現(xiàn)完全相同的指紋圖譜概率很低，但是為了鑒定淮陰苜蓿指紋圖的可靠性，本試驗對淮陰苜蓿及其余15份苜蓿均進行了鑒定。同時，為了提高鑒別能力，將3對引物擴增的產(chǎn)物混合在一起進行品種鑒定，結(jié)果證明了淮陰苜蓿指紋圖譜的可靠性。但是，構(gòu)建淮陰苜蓿指紋圖譜所使用的3對SSR引物的多態(tài)性條帶都只有3個，因此，在實際應(yīng)用中如果發(fā)現(xiàn)和淮陰苜蓿相同的指紋圖譜，應(yīng)該進一步篩選新的SSR引物補充該研究構(gòu)建的淮陰苜蓿指紋圖譜。

4 結(jié)論

1）對130對蒺藜苜蓿SSR引物在淮陰苜蓿及其余15份苜蓿材料進行擴增篩選，共得到7對擴增條帶好、條帶差異明顯、重復(fù)性好、信號強、背景清晰的SSR引物，用于淮陰苜蓿取樣策略的分析及構(gòu)建淮陰苜蓿SSR指紋圖譜。

2）用篩選的4對SSR引物對淮陰苜蓿的6個DNA混合樣的處理進行擴增，結(jié)果表明，40株DNA混合樣在進行淮陰苜蓿遺傳多樣性分析時是最佳的取樣量。

3）選用 MTB 3、MTB 13和 MTB 153這3對SSR引物所構(gòu)建的淮陰苜蓿指紋圖譜，可以應(yīng)用于對淮陰苜蓿品種的鑒定。

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